酪氨酸蛋白磷酸酶氧化还原调控的分子机理

摘要

由酪氨酸蛋白磷酸酶(ProteinTyrosinPhosphtase，PTP)和磷酸激酶(ProteinTyrosinKinase，PTK)催化的蛋白酪氨酸可逆磷酸化在动物细胞和酵母的信息传递中具有重要功能。长期以来，由于至今没有找到典型的PTK，所以认为植物中不存在PTP。目前越来越多的研究尽管已充分证明植物中的确存在PTP，但对PTP的功能及其信号转导的调控机制了解甚少。近年来，本实验室首次从玉米植物中纯化得到一个Ds-PTP即ZmRIDP1，且研究证明ZmRIDP1在细胞逆境信号传递中起着重要的作用。此外，本实验室还从拟南芥中分离得到另外一个PTP，即PTP135，且证明PTP135参与了开花信息传递。由于PTP的催化中心含有-SH，所以一般认为PTP可被DTT激活，但奇怪的是，ZmRIDP1具有和一般观点完全相反的性质，即被DTT抑制而不是激活，具有如此性质的PTP无论在动物还是在植物中都未曾报道，因此对其氧化还原调控分子机理的研究具有十分重要的意义。PTP135-DNA插入突变体在表型上和PhyB突变体完全一致。为揭示PTP135是否和PhyB直接相关，本研究试图体外表达PTP135，在此基础上，通过Pull-down技术确认两者之间的直接相互作用关系。 研究结果表明，ZmRIDP1和AtPTPKIS1及LePTPKIS1的基因序列相似性达59％和62％，但是在ZmRIDP1氨基酸序列第151和第181位与AtPTPKIS1和LePTPKIS1不同，是由两个半胱氨酸构成。半胱氨酸在蛋白的三级构象中起到非常重要的作用，受氧化还原调控。我们推测ZmRIDP1受还原剂抑制是因为半胱氨酸的调控。点突变实验表明该蛋白在181位半胱氨酸突变后，由被还原剂抑制变为被还原剂激活。二硫键测定进一步表明，151位突变蛋白与未突变蛋白及181位突变蛋白在二硫键数量上相差约10％，这意味着该蛋白可能形成了分子间的二硫键。因此，分子内或分子间二硫键的形成可能是调控PTP活性的新机制。采用大肠杆菌PGEX-6P体系对PTP135进行了表达。SDS-PAGE分析表明该蛋白在IPTG诱导下得到表达，分子量与预期相吻合。GST纯化柱纯化后得到一条单一条带，分子量与预期相吻合。对纯化后的蛋白进行了活性分析，实验表明该基因编码的蛋白能使酪氨酸磷酸酶专一性的底物脱磷酸化，并且对酪氨酸蛋白磷酸酶专一性抑制剂PAO高度敏感。该研究为通过Pull-down技术进一步探讨PTP135和PhyB之间的直接关系奠定了重要基础。

目录

文摘

英文文摘

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文献综述

目的和意义

第一章酪氨酸蛋白磷酸酶氧化还原调控的分子机理

第二章拟南芥PTP的克隆及体外表达

讨论

结论

参考文献

致谢

作者简历

附录