淡色库蚊和鲫鱼体内乙酰胆碱酯酶的生物化学性质比较研究

摘要

本文以淡色库蚊(Culexpipienspallens)和鲫鱼(Carassiusauratus)为研究对象，系统研究了淡色库蚊和鲫鱼体内乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的生物化学特性及其对抑制剂的敏感度以及一些杀虫药剂对淡色库蚊幼虫的毒力。用亲和柱层析技术对雌雄鲫鱼鱼脑AChE进行了纯化，比较分析了鲫鱼性别之间的差别；并对雌雄鲫鱼鱼脑AChE基因进行了克隆和序列分析。研究结果如下： 1.研究了淡色库蚊体内和雌雄鲫鱼脑部AChE的粗酶液对碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)、β-甲基硫代乙酰胆碱(β-MTCh)、丙酰硫代胆碱(PrTCh)、丁酰硫代胆碱(BuTCh)4种底物专一性，根据Km值，淡色库蚊的AChE对4种底物亲和性的差异不显著(P＜0.05)，而鲫鱼脑部AChE对4种底物亲和性的差异显著(P＜0.05)，其中对ATCh的Km最小，Vmax最大。Vmax显示，淡色库蚊和鲫鱼的AChE对4种底物水解效率的高低顺序为ATCh＞PrTCh＞β-MTCh＞BuTCh。 2.毒扁豆碱、DDVP、涕灭威和灭多威对淡色库蚊AChE以及3种氨基甲酸酯类农药对雄性和雌性鱼脑AChE抑制的时间进程曲线是一致的。通过比较8种杀虫药剂对淡色库蚊和鲫鱼AChE的IC50值，发现淡色库蚊和鲫鱼的AChE都对克百威的敏感度最高，对涕灭威最低。 3.基于LC50值的比较，在实验内测定了9种药剂对淡色库蚊幼虫的毒力，淡色库蚊对毒死蜱的敏感度最高，LC50值为0.001μg/mL，对硫双灭多威的敏感性最低，LC50值为0.957μg/mL。灭多威、硫双灭多威、克百威，丁硫克百威等4种药剂对AChE的抑制能力(ki值和IC50)与其对淡色库蚊毒力(LC50)值没有一致的对应关系。 4.以ATCh和BuTCh作为底物检测雌雄鲫鱼体内不同组织器官中AChE和BuChE的活性，发现脑部所含的AChE的比活力最高，占所有组织的50％以上；鲫鱼的肌肉中不但存在水解ATCh的AChE，也存在水解BuTCh的BuChE。 5.比较研究了不同性别鲫鱼脑AChE对灭多威、硫双灭多威、克百威，丁硫克百威等4种氨基甲酸酯类杀虫剂的敏感度，硫双灭多威对雌鱼AChE的ki值显著高于其对雄鱼的ki值；4种药剂对雌鱼脑AChE的k2值都显著大于对雄鱼脑AChE的k2值。丁硫克百威抑制雌鱼脑AChE的氨基甲酰化AChE的恢复速率明显比雄鱼脑AChE快(基于k3值的比较)。 6.研究了氯磷定(2-PAM)，双磷定(TMB4)，双复磷(OBI)和酰胺磷定(HI-6)等4种AChE恢复剂对鱼脑磷酰化AChE的恢复能力。基于重活化率的比较，OBI对甲胺磷抑制AChE的恢复效果最好；OBI和TMB4对毒死蜱抑制AChE的恢复效果好，2-PAM对DDVP抑制AChE的恢复效果最好。恢复剂本身对AChE的活性都有一定的抑制作用，其中双磷定(TMB4)对AChE的抑制率最高，在实验条件下达到44.9％，HI-6对AChE的抑制率最低为11.5％。 7.用亲和层析的方法对雌雄鱼脑AChE进行了较好的纯化，对雌雄鱼纯化倍数分别为1521倍和2089.5倍。对纯化前后的雌雄鱼脑的AChE的生物化学特性及对药剂的敏感性进行了比较，雌雄鲫鱼纯化后AChE对ATCh亲和力比纯化前增加了(基于Km值的比较)，纯化后的AChE对DDVP和丁硫克百威的敏感度明显增加100倍左右。 8.通过RT-PCR分别克隆了鲫鱼脑AChE基因片段，长度为1060bp，编码353个氨基酸(Genbank上注册号为AY847745)，并对其进行了生物信息学的分析。

目录

文摘

英文文摘

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第一章引言

第二章农药对淡色库蚊AChE和幼虫的影响

第三章雌雄鲫鱼脑部AChE生物化学性质的比较研究

第四章氨基甲酸酯类农药对鲫鱼脑部AChE的抑制动力学研究

第五章四种AChE恢复剂对磷酰化AChE的恢复作用

第六章鲫鱼脑部AChE的纯化

第七章雌雄鱼脑AChE基因片段的克隆

第八章总结

参考文献

致谢

作者简历