东方蜜蜂和西方蜜蜂的毒理学特性比较研究

摘要

本论文从羧酸酯酶(CarE)测定方法、靶标酶和解毒酶体躯和亚细胞分布、发育期变化规律、化学农药毒力测定以及亚致死剂量化学农药对东方蜜蜂Apis cerana和西方蜜蜂Apismellifera解毒酶影响等方面进行了系统的比较研究，以期为蜜蜂保护，尤其是我国东方蜜蜂保护提供依据。同时，研究了氟胺氰菊酯对西方蜜蜂和大蜂螨选择毒性，明确了大蜂螨抗性水平，确定了抗性机制，为中国大蜂螨防治提供理论和应用依据。实验结果如下： 1．以α-乙酸萘酯(α-NA)为底物，采用正交方法确定了西方蜜蜂CarE活力测定最佳条件为酶终浓度0.3个腹部/mL、底物终浓度4×10<'-4>mol/L、pH值7.0、温度35℃、时间10 min。 2．比较研究了两种蜜蜂成年工蜂靶标酶和解毒酶体躯和亚细胞分布。头部是蜜蜂乙酰胆碱酯酶(AChE)活性最高部位，在细胞内活性主要集中在线粒体层。CarE主要集中在腹部，在细胞内主要存在于细胞液中。谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性主要集中于中肠，在细胞中主要位于细胞液中。但不同蜂种不同组织的不同亚细胞层比例不同。东、西方蜜蜂各躯段CarE与底物亲和力不同。 3．从幼虫到成虫，GSTs和CarE活性存在显著变化，AChE活性变化不显著。东方蜜蜂AChE和GSTs活性随着发育进程呈增加趋势，西方蜜蜂工蜂体内AChE活性呈减少趋势。 东方蜜蜂除蛹期AChE活性显著高于西方蜜蜂外，其它发育期AChE和GSTs活性低于西方蜜蜂，CarE活性则高于西方蜜蜂(α-NA为底物)。不同发育阶段东、西方蜜蜂CarE底物特异性不同。西方蜜蜂雄蜂幼虫和蛹三种酶活性高于工蜂。 4．西方蜜蜂成年工蜂三种酶活性随日龄变化。21日龄时GST活性显著升高。 5．AchE、CarE和GST活性在蜂种间存在显著差异。意大利蜂AChE活性最高。高加索蜂GST活性活性最高。以仅α-NA为底物时，蜂种间CarE差异不显著。以β-NA为底物时，卡尼鄂拉蜂CarE活性最高。不同蜂种以β-NA为底物时CarE活性均高于以α-NA为底物活性。 6．对甲氰菊酯等5种化学药剂，东方蜜蜂比西方蜜蜂更敏感。LC<,5>五种化学药剂在24h内对东、西方蜜蜂解毒酶作用不同。农药对东方蜜蜂CarE、AChE(马拉硫磷除外)影响大于西方蜜蜂，而对GST影响则是西方蜜蜂大于东方蜜蜂(双甲脒除外)。 7．LC5甲氰菊酯、灭多威和马拉硫磷能诱导东方蜜蜂AChE活性增加，降低西方蜜蜂AChE活性。LC<,5>氟胺氰菊酯诱导西方蜜蜂AChE活性增加，抑制东方蜜蜂AChE活性增加。LC<,5>双甲脒能诱导东方蜜蜂AChE，对西方蜜蜂影响不大。五种农药均可以诱导东方蜜蜂腹部CarE增加，其中氟胺氰菊酯是先诱导再抑制。五种化学农药均抑制西方蜜蜂体内CarE活性。除灭多威外的四种化学药剂均抑制西方蜜蜂GST活性，灭多威在2-16h诱导，20-24h抑制。对东方蜜蜂而言，甲氰菊酯、灭多威能抑制GST酶活性：双甲脒诱导GST；马拉硫磷和氟胺氰菊酯先抑制再诱导。 8．生物测定结果表明，西方蜜蜂对氟胺氰菊酯的耐受性要明显高于大蜂螨。不同地方大蜂螨种群对氟胺氰菊酯抗性水平不同。Beijing2和Zhejiang种群为氟胺氰菊酯敏感种群。抗性分析结果表明，多功能氧化酶活性增加，AchE敏感度下降可能是打蜂螨抗性机制。

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文摘

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论文说明：图表目录

声明

第一章引言

1.1蜜蜂在农业中的地位

1.1.1蜜蜂在农业增产的重要作用

1.1.2蜜蜂在农业可持续发展的作用

1.1.3我国养蜂业在世界的地位

1.2化学农药与蜜蜂

1.2.1农药对蜜蜂毒性的生物测定

1.2.2亚致死剂量杀虫剂对蜜蜂的影响

1.3东方蜜蜂和西方蜜蜂的比较研究

1.4蜜蜂的解毒酶研究进展

1.4.1蜜蜂乙酰胆碱酯酶研究

1.4.2蜜蜂羧酸酯酶研究

1.4.3蜜蜂谷胱甘肽硫转移酶研究

1.4.4蜜蜂多功能氧化酶研究

1.5大蜂螨对蜜蜂的危害及抗性机制研究

1.5.1大蜂螨的生物测定方法

1.5.2大蜂螨的抗性机制研究

1.5.3大蜂螨的钠离子通道研究

1.6研究目的和意义

1.6.1研究目的

1.6.2研究意义

第二章蜜蜂羧酸酯酶的最适反应条件的测定

2.1材料与方法

2.1.1试剂

2.1.2试虫来源

2.1.3酶源制备

2.1.4羧酸酯酶活力测定方法

2.1.5蛋白质含量测定

2.1.6实验设计

2.2结果与分析

2.2.1正交试验结果的极差分析

2.2.2正交试验结果的方差分析

2.2.3试验因子各水平间的差异显著性比较

2.3讨论

第三章蜜蜂靶标酶和解毒酶的体躯与亚细胞分布研究

3.1材料与方法

3.1.1试虫

3.1.2试剂及仪器

3.1.3蜜蜂AChE、CarE和GST的体躯分布

3.1.4 AChE、CarE和GST的亚细胞分布

3.1.5 AChE活力测定

3.1.6 CarE活力测定

3.1.7 GST活性测定

3.1.8可溶性蛋白含量测定

3.2结果与分析

3.2.1东方蜜蜂和西方蜜蜂中AchE的组织分布

3.2.2东方蜜蜂和西方蜜蜂中CarE的组织分布

3.2.3东方蜜蜂和西方蜜蜂中GST的组织分布

3.2.4东方蜜蜂和西方蜜蜂AchE的亚细胞分布

3.2.5东方蜜蜂和西方蜜蜂中CarE的亚细胞分布

3.2.6东方蜜蜂和西方蜜蜂中GST的亚细胞分布

3.3讨论

第四章蜜蜂发育期靶标酶和解毒酶变化的研究

4.1材料与方法

4.1.1试虫

4.1.2试剂及仪器

4.1.3酶源提取与制备

4.1.4 AChE活力测定

4.1.5 CarE活力测定

4.1.6 GST活性测定

4.1.7可溶性蛋白含量测定

4.2结果与分析

4.2.1东方蜜蜂和西方蜜蜂AchE的发育期变化

4.2.2东方蜜蜂和西方蜜蜂CarE发育期变化研究

4.2.3东方蜜蜂和西方蜜蜂不同发育期羧酸酯酶Km值测定

4.2.4东方蜜蜂和西方蜜蜂GST的发育期变化

4.2.5西方蜜蜂成年工蜂AchE的日龄变化

4.2.6西方蜜蜂成年工蜂羧酸酯酶的日龄变化研究

4.2.7西方蜜蜂成年工蜂谷胱甘肽硫转移酶的日龄变化研究

4.2.8AchE的蜂种比较研究

4.2.9不同蜂种CarE活性比较

4.2.10不同蜂种GSTs活性比较

4.3讨论

第五章化学农药对蜜蜂靶标酶和解毒酶的影响研究

5.1材料与方法

5.1.1试虫

5.1.2试剂、化学药剂及仪器

5.1.3农药对蜜蜂的毒性测定

5.1.4亚致死剂量药剂对蜜蜂影响的处理方法

5.1.5酶源提取与制备

5.1.6 AChE活力测定

5.1.7 CarE活力测定

5.1.8 GST活性测定

5.1.9化学农药对蜜蜂CarE的离体抑制测定

5.1.10可溶性蛋白含量测定

5.2结果与分析

5.2.1东方蜜蜂和西方蜜蜂对五种化学药剂的敏感性比较

5.2.2五种LC5剂量药剂对东方蜜蜂和西方蜜蜂的AChE活性影响

5.2.3五种LC5剂量药剂对东方蜜蜂和西方蜜蜂的CarE活性影响

5.2.4五种LC5剂量药剂对东方蜜蜂和西方蜜蜂的GSTs活性影响

5.2.5五种药剂对东方蜜蜂和西方蜜蜂的CarE离体抑制作用

5.3讨论

第六章氟胺氰菊酯对大蜂螨和西方蜜蜂选择毒性研究

6.1材料与方法

6.1.1试虫

6.1.2试剂及仪器

6.1.3蜜蜂和大蜂螨对氟胺氰菊酯抗性的生物测定方法

6.1.4 AChE、CarE、GST和细胞色素P450酶液制备

6.1.5 AChE活力测定

6.1.6 CarE活力测定

6.1.7 GST活性测定

6.1.8细胞色素P450含量测定

6.1.9可溶性蛋白含量测定

6.2结果与分析

6.2.1西方蜜蜂和大蜂螨对氟胺氰菊酯抗性的生物测定结果

6.2.2西方蜜蜂和大蜂螨的AChE、CarE和GST活性测定结果

6.3讨论

第七章总结

7.1总结

7.2本研究的创新之处

7.3讨论

参考文献

致谢

作者简历