拟南芥ATAF1转录因子在干旱胁迫响应中的功能分析

摘要

干旱胁迫是在世界范围内影响植物生长发育、作物生产的主要环境因子之一。在长期的生物进化过程中，植物自身已经发展了多种抵抗干旱胁迫的机制，以通过调节自身生理和代谢变化来抵御干旱。其中的一个重要机制就是通过干旱胁迫信号转导来启动干早胁迫响应基因的表达。 在胁迫信号转导途径中，转录因子由于能够调节多个胁迫响应功能基因的表达而备受关注。在拟南芥中，多种转录因子基因已被证明参与了植物对干旱胁追的响应，它们包括AP2/ERF、bZIP、MYB、MYC、zinc fingerprotein和NAC等类蛋白。主要是鉴定了一个新的受干旱、盐和ABA诱导表达的NAC蛋白-ATAF1，并用遗传学方法证明它通过负调控胁迫响应功能基因的表达来参与干旱胁迫响应。 NAC类蛋白是植物所特有的一类转录因子蛋白。其名称来源于矮牵牛的NAM基因、拟南芥中的ATAT基因和CUC基因。虽然ATAF1是最早被发现的NAC类蛋白之一，但是它的生物学功能至今还不清楚。 主要围绕ATAF1在水分胁迫下的表达和生物学功能开展了研究。首先，用Northernblot的方法证明了ATAF1在mRNA水平上受到干旱和盐胁迫的诱导，而水可能抑制其表达。进一步利用实时定量。PCR的方法证明ATAFI也受到外源ABA的诱导。 组织化学分析ATAF1启动子驱动的GUS报告基因表明，ATAFI几乎在拟南芥的所有组织中都有表达，而在维管系统中表达较高，在气孔保卫细胞中也有较强表达。进一步在干旱、高盐和ABA条件下分析启动子活性发现ATAFI启动子是一个诱导型启动子。 基因枪转化洋葱表皮细胞瞬时表达实验表明ATAFl-GFP融合蛋白特异定位在细胞核中，说明ATAF1是一个核蛋白。酵母激活实验证明在酵母中ATAF1能够激活报告基因的表达，而具其激活域位于C-末端。这些实验结果与转录因子的特征相符合。 为了深入研究ATAF1在干旱胁迫下的生物学功能，分离得到了ATAF1的两个不同插入位点T-DNA突变体，分别命名为ataf1-1，和ataf1-2。干旱耐受性分析表明，在干旱胁迫下突变体表现出比野生型高约7倍的复水成活率。为了深入探讨ATAF1参与干旱胁迫的分子机制，利用northern杂交的方法验证明了在干旱胁迫下一些胁迫响应marker基因在突变体中的表达变化，这些基因包括COR47，ERD1O，KINl，RD22和RD29A。实验结果表明在干旱下这些基因在突变体中的表达水平都要明显高于在野生型中的表达水平。这些实验结果暗示ATAFl可能在ABA依赖的和ABA不依赖的干旱胁迫信号途径中都起作用。 总之，实验结果表明，拟南芥ATAF1可能作为一个转录调节因子在干旱胁迫下负调胁迫响应功能基因的表达来参与植物对干旱胁迫的响应。

目录

文摘

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论文说明：缩略词

声明

第一章文献综述

第二章ATAF1基因克隆及在逆境胁迫下的表达分析

前言

2.1实验材料

2.1.1植物材料和菌株

2.1.2质粒载体

2.1.3工具酶及试剂盒

2.1.4杂交膜及放射性同位素

2.1.5主要仪器

2.1.6 PCR引物

2.1.7常用培养基

2.2实验方法

2.2.1总RNA提取及质量鉴定

2.2.2 cDNA的获得及探针的制备

2.2.3 Northern blotting分析

2.2.4 ProATAF1-GUS转基因拟南芥的获得

2.3结果和分析

2.3.1 ATAF1的基因结构

2.3.2 ATAF1基因的cDNA克隆

2.3.3ATAF1蛋白序列比对分析和拟南芥NAC蛋白家族进化树分析

2.3.4 ATAF1基因在mRNA水平上的表达受到高盐和干旱的强诱导

2.3.5植物逆境激素ABA对ATAF1基因在mRNA水平上表达的影响

2.3.6 ATAF1启动子融合GUS报告基因转基因植株的分析

2.4 讨论

第三章ATAF1蛋白的亚细胞定位和转录激活活性分析

前言

3.1实验材料

3.1.1材料和菌株

3.1.2质粒载体

3.1.3工具酶及试剂盒

3.1.4主要仪器

3.1.5培养基

3.2实验方法

3.2.1常规分子生物学方法

3.2.2洋葱表皮基因枪瞬时转化

3.2.3共聚焦显微镜观察和图像处理

3.2.4酵母感受态细胞的制备和转化

3.2.5 β-galactosidase filter assays(阳性克隆的显色反应)

3.3结果与分析

3.3.1 ATAF1的亚细胞定位

3.3.2 ATAF1的转录激活特性分析

3.4讨论

第四章拟南芥ATAF1参与干旱胁迫响应的分子机理探讨

前言

4.1实验材料

4.1.1植物材料和菌株

4.1.2质粒载体

4.1.3工具酶及试剂盒

4.1.4主要仪器

4.1.5杂交膜及放射性同位素

4.1.6 Northern blot探针扩增引物

4.1.7 T-DNA插入突变体鉴定引物

4.2实验方法

4.2.1基因组DNA小量提取方法

4.2.2 PCR鉴定突变体纯合植株

4.2.3 RT-PCR检测

4.2.4 RNA提取和Northern杂交

4.2.5干旱处理提取RNA

4.2.6 ataf1突变体植株的干旱胁迫耐受性实验

4.2.7离体叶片的失水速率分析

4.3结果与分析

4.3.1 ATAF1 T-DNA插入突变体的鉴定

4.3.2 ATAF1 T-DNA插入突变体的干旱耐受性分析

4.3.3 ATAF1 T-DNA插入突变体的离体叶片失水率实验

4.3.4干旱胁迫诱导Marker基因在突变体中的表达

4.4 讨论

第五章结论和展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

致 谢

作者简历