当归红芪合剂超滤膜提取物对H2O2致人脐静脉内皮细胞损伤的影响

摘要

目的:观察当归红芪合剂超滤膜提取物对过氧化氢(H2O2)损伤人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的保护作用和内皮细胞凋亡相关基因在此过程中的作用,探讨其在心脑血管疾病治疗中的机制。
　　方法:用200μmol·L-1 H2O2制造HUVEC损伤模型；按分组把不同浓度、不同分子量（5万分子量，10万分子量，20万分子量）的当归红芪合剂超滤膜提取物于损伤后加入,分别测定细胞活力(MTT法)，观察当归红芪合剂超滤膜提取物对H2O2损伤内皮细胞活性的影响；实验分正常对照组、单纯药物组、H2O2损伤组、药物干预组，采用黄嘌呤氧化酶法检测细胞中SOD活力；采用硫代巴比妥酸（TBA）法检测丙二醛（MDA）活力；流式细胞仪技术检测细胞周期及细胞凋亡；化学法检测细胞内Ca2+浓度及细胞培养上清液中NO的浓度；应用RT-PCR和微阵列相结合的实验新技术―PCR Array‖检测与内皮细胞损伤相关的分子在各组间的差异表达；RT-PCR技术从mRNA水平检测各组与凋亡相关的基因的表达；Western Blot技术从蛋白水平检测各组凋亡相关基因的表达。
　　结果:
　　1. MTT结果显示：100、200、300μmol·L-1的H2O2分别作用ECV-304细胞6h、12h、24h、48h后细胞活性明显下降，与正常对照组比较有显著性差异(P﹤0.05)。200μmol·L-1的H2O2孵育6h，细胞活性值为正常对照组细胞活性值的一半（LD50）,细胞损伤适中。
　　2.不同浓度当归红芪合剂超滤膜提取物用药组与对照组之间MTT值有显著性差异（P<0.05）；当归红芪合剂超滤膜提取物作用ECV-304细胞32h，在1.5g/L～21.0g/L浓度范围内有显著的促增殖作用。尤其以6.0g/L～15.0g/L浓度范围增殖作用达高峰。
　　3.H2O2+当归红芪合剂超滤膜提取物5万、10万、20万分子量6.0g/L,与对照组比较有显著性差异（P﹤0.05）；与 H2O2损伤组相比有显著性差异（P﹤0.05），且以10万分子量6.0g/L的增殖作用最强；
　　4.200μmol·L-1 H2O2作用ECV304细胞6h后可以明显降低SOD的活力，提高MDA的含量，与正常对照组相比具有显著性差异（P﹤0.05）；药物干预组与 H2O2组相比有显著性差异（P﹤0.05）。与正常对照组比较，H2O2损伤组细胞内Ca2+浓度明显上升（P﹤0.05）；与H2O2损伤组比较，药物干预组细胞内Ca2+浓度明显下降（P﹤0.05）。
　　5.与正常对照组比较，H2O2损伤组细胞凋亡率明显增加（P﹤0.05），细胞HSP70基因表达上调（P﹤0.05），eNOSmRNA表达下调（P﹤0.05），细胞培养上清液中NO含量降低（P﹤0.05）。与H2O2损伤组比较，药物干预组细胞凋亡率明显降低（P﹤0.05），细胞HSP70基因表达上调（P﹤0.05），eNOSmRNA表达上调（P﹤0.05），细胞培养上清液中NO含量升高（P﹤0.05）。
　　结论：
　　1.过氧化氢可以引起内皮细胞存活率下降，其中以200μmol·L-1作用6h细胞损伤适中。
　　2.当归红芪合剂超滤膜提取物作用ECV304细胞32h，在1.5g/L～21.0g/L浓度范围内有显著的促增殖作用。尤其以6.0g/L～15.0g/L浓度范围增殖作用达高峰。
　　3.当归红芪合剂超滤膜提取物对H2O2损伤后的内皮细胞有保护作用,其中以10万分子量，6.0g/L保护效果最为明显。且其保护作用可能是通过调节细胞周期参与了对ECV304增殖的影响。
　　4.当归红芪合剂超滤膜提取物对 H2O2致内皮损伤的细胞具有保护作用，其作用是通过提高SOD的活力，降低MDA的活力，减少细胞内Ca2+的释放，以及减少内皮细胞凋亡等机制来实现的。
　　5.当归红芪合剂超滤膜提取物对 H2O2引起的内皮细胞损伤有拮抗作用，具有抗H2O2致人脐静脉内皮细胞凋亡的作用，具有促进HSP70基因的表达，维持正常内皮细胞功能，上调eNOSmRNA表达，维持NO合成与分泌的作用。

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缩 略 词

前言

立题依据

1.现代医学对血管内皮损伤的认识和研究

2.传统医学对血管内皮损伤的认识和研究

3.中医药对血管内皮细胞的保护作用

4.当归、红芪对血管内皮细胞的保护作用

实 验 研 究

实验一 过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞氧化损伤模型构建

实验二 10万分子量当归红芪合剂超滤膜提取物对内皮细胞活性的影响

实验三 不同分子量范围当归红芪合剂超滤膜提取物对过氧化氢损伤内皮细胞活性及细胞周期的影响

实验四 10 万分子量当归红芪合剂超滤膜提取物对过氧化氢损伤内皮细胞SOD活力、丙二醛含量、细胞内Ca2+含量的影响

实验五 10 万分子量当归红芪合剂超滤膜提取物对过氧化氢致内皮细胞凋亡的影响[63]

结语

一 结论

二 问题与展望

参考文献

致谢

在学期间的研究成果