藏紫菀总黄酮的提取纯化及其对减压缺氧小鼠的保护作用和机制研究

摘要

目的:研究藏紫菀中总黄酮活性成分的提取与纯化工艺；探讨藏紫菀总黄酮对模拟急性高原减压缺氧小鼠的保护作用及其机制。
　　方法:采用正交实验法优选藏紫菀总黄酮的最佳提取工艺；采用大孔吸附树脂优选藏紫菀总黄酮的最佳纯化工艺；采用常压密闭缺氧耐力实验和急性减压缺氧耐受力实验探讨藏紫菀总黄酮的抗缺氧作用，从不同剂量组中筛选出最佳剂量；采用低压低氧动物实验舱，模拟高原缺氧环境，造成小鼠高原损伤模型，通过HE染色观察小鼠脑和心组织的病理变化，同时检测相关生化指标，考察藏紫菀总黄酮的抗急性高原缺氧损伤作用，并通过western blot蛋白分析法，初步确定其作用机制。
　　结果:
　　1.藏紫菀总黄酮的最佳提取工艺为：藏紫菀药材中加入12倍量的水，加热回流提取2次，每次提取2h，出膏率可以达到24.58％，总黄酮含量可以达到29.7%。
　　2.通过静态和动态吸附行为考察，从10种树脂中优选出解吸率最佳的LX-60树脂进行纯化工艺研究，最终确定藏紫菀总黄酮的最佳纯化工艺为：上样质量浓度4.124mg/mL，上样流速为1ml/min，静置吸附15min，冲洗用水2BV，洗脱剂选用60%乙醇，4BV洗脱，洗脱流速1ml/min，以总黄酮含量为指标，确定径高比为2.5:8。
　　3.在小鼠常压密闭缺氧耐力实验和急性减压缺氧耐受力实验中，与未给药小鼠的存活时间和死亡率相比较，口服藏紫菀总黄酮小鼠存活时间延长和死亡率降低。其中高剂量组的存活时间可延长32%，最佳给药剂量为500mg/kg。
　　4.小鼠减压缺氧实验中，与未缺氧小鼠脑和心肌组织中的指标比较，减压缺氧小鼠脑和心肌组织中MDA，LD，LDH，H2O2和CK均显著性升高；与缺氧模型组比较，藏紫菀总黄酮组脑和心肌组织中MDA，LDH，H2O2和CK均显著性降低。
　　5.小鼠减压缺氧实验中，与未缺氧小鼠脑和心肌组织中的指标比较，减压缺氧小鼠脑和心肌组织中CAT，SOD，GSH和GSH-PX有显著性降低，与缺氧模型组比较，藏紫菀总黄酮组脑和心肌组织中CAT，SOD，GSH和GSH-PX有显著性升高。
　　6.小鼠减压缺氧实验中，与正常组比较，缺氧模型组脑组织中HIF-1α、VEGF、Nrf2和caspase3有显著性升高，SOD和bcl2/bax有显著性降低；与缺氧模型组比较，藏紫菀总黄酮组脑组织中HIF-1α、VEGF和caspase3有显著性降低， Nrf2、SOD和bcl2/bax有显著性升高。
　　结论：
　　1.采用正交实验法优选的藏紫菀总黄酮提取工艺，制定了确切有效的提取方法，工艺简单可行。
　　2.采用大孔吸附树脂优选的藏紫菀总黄酮纯化工艺，可极大地提高总黄酮的含量，可适用于工业化生产。
　　3.小鼠常压密闭缺氧耐力实验和急性减压缺氧耐受力实验说明藏紫菀总黄酮具有良好的抗缺氧活性。
　　4.小鼠减压缺氧实验表明：藏紫菀总黄酮可以降低缺氧诱导机体产生的脂质过氧化、无氧糖酵解和氧自由基；提高抗氧化酶活力，增加机体抗氧化能力，抵御机体的氧化应激损伤。
　　5.通过对抗缺氧，抗氧化和细胞凋亡三方面通路相关蛋白的测定，证实藏紫菀总黄酮抗缺氧作用机制可能与减轻自由基损伤，提高抗氧化酶能力，降低细胞凋亡有关。

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缩略词表

第一章 前 言

1.1 藏紫菀化学成分研究进展

1.2 藏紫菀的药理作用研究进展

1.3 急性高原病研究进展

1.4 氧化应激与急性高原病

1.5 缺氧与急性高原病

1.6 研究内容

1.7 技术路线

第二章 藏紫菀总黄酮提取工艺研究

2.1 仪器与材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4实验讨论

第三章 藏紫菀总黄酮纯化工艺研究

3.1 仪器与材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 实验讨论

第四章 藏紫菀总黄酮的抗缺氧活性研究

4.1 仪器与材料

4.2 实验方法

4.3 统计学处理

4.4 实验结果

4.5 实验讨论

第五章 藏紫菀总黄酮对减压缺氧小鼠的保护作用

5.1 仪器与材料

5.2 实验方法

5.3 统计学处理

5.4 实验结果

5.5 实验讨论

第六章 藏紫菀总黄酮对减压缺氧损伤小鼠的保护机制

6.1 仪器和试剂

6.2 实验方法

6.3 统计学方法

6.4 实验结果

6.5 实验讨论

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文及参与的科研工作