久泻灵颗粒对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎模型大鼠TLR4、NF-κBp65及炎性细胞因子表达的影响

摘要

目的：
　　阐明久泻灵颗粒对脾肾阳虚型UC模型大鼠结肠组织病理形态变化的影响以及对IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ炎症因子和TLR4、NF-κB p65蛋白基因表达的影响，初步阐释以温补脾肾法为指导的中药制剂久泻灵颗粒治疗UC的作用机理和科学内涵，为临床治疗UC用药的探讨提供有效的理论依据。
　　方法：
　　1、将60只SPF级Wistar大鼠随机分为空白组和模型组，采用灌服大黄水煎液加肌肉注射氢化可的松的方法建立中医证型“脾肾阳虚”模型，同时结合TNBS（2,4,6-三硝基苯磺酸）加50％乙醇混合灌肠法建立西医病“UC”模型。造模成功后将模型组随机分为脾肾阳虚型UC模型7天、14天、21天组，取材后进行结肠组织病理切片制备，采用ELISA法检测FT3、FT4、T的含量。
　　2、将90只SPF级Wistar大鼠随机分为空白组和模型组，造模方法和实验一相同。造模成功后将模型组随机分为脾肾阳虚型UC模型组、久泻灵颗粒治疗7天、14天、21天组和阳性对照组（SASP组）。久泻灵颗粒治疗组按各组要求分别给药7天、14天、21天，阳性对照组给予柳氮磺胺吡啶治疗。取材后选用病理学方法（肉眼观察和HE染色镜下观察）来观察各组大鼠结肠组织病理形态变化、ELISA法检测大鼠血清及组织中IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量、免疫组化法检测大鼠结肠组织中TLR4、NF-κB p65蛋白表达、RT-qPCR法检测大鼠结肠组织中TLR4、NF-κB p65基因的表达。
　　结果：
　　1、ELISA法检测大鼠血清中FT3、FT4、T的含量：与空白组比较，模型7天、14天、21天组中FT3、FT4、T的含量均有所降低，其中模型21天组差异显著（P<0.01）。
　　2、ELISA法检测大鼠血清及组织中IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量：与空白组比较，UC模型组中IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均有所升高，具有显著性差异（P<0.01）；与模型组比较，久泻灵颗粒治疗7天、14天、21天组及阳性对照组中各炎症因子的含量均有所降低（P<0.01或P<0.05），且以中药治疗21天组差异最为显著（P<0.01）。
　　3、RT-qPCR法检测大鼠结肠组织中TLR4、NF-κB p65 mRNA表达：与模型组比较，空白组结肠组织中TLR4、NF-κB p65 mRNA表达量明显低于模型组（P<0.01），差异有统计学意义；久泻灵颗粒治疗7天、14天、21天组结肠组织中TLR4、NF-κB p65 mRNA表达量均有所降低（P<0.01或P<0.05）。
　　4、免疫组化法检测大鼠结肠组织中TLR4、NF-κB p65蛋白表达：
　　TLR4表达：（1）镜下观察可见：模型组大鼠肠粘膜上皮和固有层单个核细胞都有TLR4阳性表达，表达强度高于空白组，并且越接近肠腔表达越强。其余各治疗组大鼠TLR4呈弱度或中等强度表达。（2）TLR4阳性细胞灰度值结果为：与空白组比较，模型组大鼠结肠组织中TLR4表达显著增强（P<0.01），差异有统计学意义；与模型组比较，治疗后其他各组TLR4表达均有所减弱（P<0.01或P<0.05）。
　　NF-κB p65表达：（1）镜下观察可见：模型组中NF-κB p65阳性表达为单核-巨噬细胞，呈现胞浆阳性，大鼠结肠粘膜上皮和固有层单个核细胞中都可以见到，表达强度明显高于空白组。其余各治疗组大鼠NF-κB p65阳性细胞呈弱度或中等强度表达。（2） NF-κB p65阳性细胞灰度值结果为：与空白组比较，模型组NF-κB p65表达显著增强（P<0.01），差异有统计学意义；与模型组比较，治疗后各组NF-κB p65表达显著减弱（P<0.01或P<0.05）。
　　结论：
　　1、脾肾阳虚是UC反复发病，病情迁延难愈的关键病机，以温补脾肾法为指导的久泻灵颗粒治疗UC疗效显著，为临床用药提供了有效依据。
　　2、久泻灵颗粒可以明显降低脾肾阳虚型UC模型大鼠血清及结肠组织中IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ炎症因子的含量，进而抑制炎性细胞浸润，减少炎症活性产物的释放，减轻机体肠粘膜的炎症反应和组织损伤程度，促进肠粘膜修复。
　　3、久泻灵颗粒可以明显降低脾肾阳虚型UC模型大鼠中TLR4、NF-κB p65基因的转录和蛋白的表达，减轻粘膜炎症反应，促进肠粘膜修复。

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中文摘要

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英文缩略词表

前言

立 题 依 据

第一部分 理论研究

1 中医学关于UC的研究

1.1 病名范畴

1.2 病因病机

1.3 辨证论治

1.4 中医治疗

2 现代医学关于UC的研究

2.1 流行病学研究

2.2 病因及发病机理

2.3 西医治疗

第二部分 实验研究

1 实验一

1.1 技术路线图

1.2 实验材料

1.3 实验方法

1.4 实验结果

2 实验二

2.1 技术路线图

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果

3 讨论

3.1 模型制备方法的选择

3.2 脾肾阳虚型UC模型评估

3.3 久泻灵颗粒组方分析

3.4 大鼠结肠组织病理切片结果分析

3.5 炎症因子与UC（IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ）

3.6 TLR4、NF-κB p65与UC

结论

参考文献

附录

附录1 实验一 大鼠结肠组织病理切片

附录2 实验二 大鼠结肠组织病理切片

附录3 大鼠结肠组织免疫组化切片

附录4 实验动物质量合格证和设施使用许可证

致谢

攻读硕士研究生阶段发表的论文