Neu-p11和当归芍药散对高脂饲料喂养的慢性应激大鼠糖脂代谢的影响及HPA轴相关机制研究

摘要

目的：
　　观察新型褪黑素受体激动剂Neu-p11和当归芍药散对高脂饲料喂养的慢性应激大鼠糖脂代谢的影响，并探讨其HPA轴相关机制，为2型糖尿病的治疗提供药物新靶点和理论依据。
　　方法：
　　实验共分为五批先后进行。每批 Wistar雄性大鼠60只，随机分为正常对照组（Control）、模型组（Model）、褪黑素对照组（MLT）及3个给药处理组。正常对照组与模型组分别给予等量生理盐水，MLT组给予20 mg·kg-1褪黑素，3个给药组：第一批给予Neu-p11（剂量分别为5 mg·kg-1、10 mg·kg-1和20 mg·kg-1），第二批给予Neu-p11（剂量分别为10 mg·kg-1、20 mg·kg-1和40 mg·kg-1），第三批给予Neu-p11（剂量分别为5 mg·kg-1、10 mg·kg-1和20 mg·kg-1），第四批给予3种中药（开心散醇提物445 mg·kg-1、当归芍药散水提物3360 mg·kg-1和圣约翰草提取物300 mg·kg-1），第五批给予当归芍药散水提物（剂量分别为840 mg·kg-1、1680 mg·kg-1和3360 mg·kg-1）。均灌胃给药，给药体积为1ml·200g-1。第一批实验，采用腹腔注射葡萄糖（2.5 g·kg-1）和肾上腺素（300 mg·kg-1）分别建立急性高血糖模型，于0、30、60、120 min时测定大鼠血糖水平，并计算血糖曲线下面积。其余四批实验，正常对照组大鼠每日给予正常饮食，避免任何刺激；剩余5组大鼠采用高脂饲料喂养，同时随机进行慢性应激处理，每日应激一次，持续4~6 w；每日记录大鼠摄食、饮水量，每周测定大鼠体重和空腹血糖(FBG)水平，分别于不同时间点测定大鼠腹腔糖耐量（IPGTT）或胰岛素耐量（ITT）水平、血脂水平[包括：甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平]、血浆胰岛素（INS）、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质酮（CORT）和褪黑素（MLT）水平，收集大鼠24 h尿液测定CORT水平；实验结束后，断头处死大鼠，取肝脏和肌肉组织测定糖原含量，摘取双侧肾上腺、双侧肾脏、脾脏及肝脏组织，称重并计算脏器指数。测定肝脏葡萄糖激酶（GK）和葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）活性和松果体MLT含量；利用RT-PCR技术检测大鼠肾上腺组织褪黑素受体1（MT1）、褪黑素受体2（MT2）mRNA，海马组织糖皮质激素受体（GR）、11β羟基类固醇脱氢酶1（11β-HSD1）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α） mRNA，肝脏组织GR、MT1、MT2、葡萄糖转运体-4（GLUT-4）、过氧化物酶增殖体活化受体-γ（PPAR-γ）mRNA，脂肪组织GR、GLUT-4、PPAR-γ、脂联素（Adipo）、瘦素（Leptin）、TNF-α和白细胞介素-6（IL-6）mRNA表达；并利用Western Blot技术检测大鼠肝脏组织GR蛋白表达，海马和肾上腺组织MT1、MT2蛋白表达。
　　结果：
　　第一批实验结果显示：与模型组比较，Neu-p11(10 mg·kg-1)可显著降低葡萄糖诱导的30 min时的高血糖，达11.83％（P<0.05）。其余四批实验，与正常对照组相比，模型组大鼠体重增长有降低趋势，相对摄食量显著降低（P<0.05），FBG显著升高（P<0.05），糖耐量和胰岛素耐量水平显著降低（P<0.05），大鼠血浆 TC、TG显著升高（P<0.05， P<0.01），HDL-C有降低趋势，LDL-C有升高趋势；同时大鼠肝糖原和肌糖原含量显著降低（P<0.05），血浆HPA激素CRH、ACTH和CORT及INS水平有升高趋势，尿液CORT显著升高（P<0.05）。第二批实验结果显示：与模型组相比，Neu-p11给药组大鼠体重降低减缓，相对摄食量增加，FBG显著降低（P<0.05），糖耐量水平改善，血脂水平趋于正常，肝糖原含量进一步降低；前期 INS水平增加，后期 INS水平降低，HPA激素水平趋于正常。第三批实验结果显示：与模型组相比，Neu-p11(10 mg·kg-1)组大鼠体重升高，第2周相对摄食量显著增加9.38%（P<0.05）；d21时，FBG显著降低降低20.98%（P<0.01）；同时，糖耐量减低改善，TC和TG降低，HDL-C有升高趋势，LDL-C有降低趋势，肝糖原降低53.66%（P<0.01）。第四批结果显示：开心散、当归芍药散和圣约翰草可调节糖脂代谢和 HPA轴激素水平；与模型组相比，当归芍药散组糖耐量减低改善，空腹血糖降低8.45%（P<0.05），TG降低40.00%（P<0.05），LDL-C降低56.41%（P<0.05），CRH、ACTH CORT和INS水平都有降低趋势，血清MLT、肝糖和原肌糖原含量有升高趋势。第五批实验结果显示：与模型组相比，当归芍药散(1680 mg·kg-1)组 d42空腹血糖降低15.69%（ P<0.01），糖耐量水平和胰岛素耐量水平显著改善（P<0.05），d42时TG降低45.22%（P<0.05），HDL-C升高20.93%（P<0.05），肝糖原和肌糖原含量有升高趋势。
　　相关机制研究结果显示：与正常对照组比较，模型组大鼠肝脏G-6-Pase活性显著升高（P<0.05），CRH、ACTH、CORT和INS水平升高，而血浆和松果体MLT含量降低。糖脂代谢及 HPA轴相关基因和蛋白表达异常。第三批实验结果显示：与模型组相比，Neu-p11可显著调节改善上述指标，显著上调肾上腺和肝脏组织MT1和MT2 mRNA，海马、肝脏和脂肪GR mRNA（P<0.01），脂肪adipo、GLUT-4和PPAR-γmRNA（P<0.01）；下调海马组织11β-HSD1、TNF-α mRNA，脂肪组织leptin和 IL-6 mRNA（P<0.01），同时上调肝脏组织GR和海马组织MT2蛋白表达（P<0.01）。第五批实验结果显示：与模型组相比，当归芍药散可显著降低肝脏G-6-Pase活性，降低CRH、ACTH、CORT、INS水平，并具有升高 MLT水平的趋势，同时上调肾上腺组织 MT2蛋白和肝脏组织GR蛋白表达（P＜0.05）。
　　结论：
　　Neu-p11可调节葡萄糖性高血糖大鼠和高脂饲料喂养的慢性应激大鼠的糖脂代谢，其机制可能是通过调节肾上腺、海马、肝脏和脂肪组织相关基因和蛋白的表达，抑制HPA功能亢进实现的。
　　开心散、当归芍药散和圣约翰草提取物均在一定程度上可改善高脂饲料喂养的慢性应激大鼠的糖脂代谢紊乱，以当归芍药散作用最佳，其机制可能是通过促进 MLT分泌及上调其受体表达，调节HPA轴活性而实现的。

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前言

立题依据

1. T2DM的发病机制与神经内分泌免疫调节

2. MLT、HPA轴与T2DM的关系

3.新型褪黑素受体激动剂Neu-p11与糖脂代谢

4.当归芍药散、MLT与糖脂代谢

5.课题原理

6.研究内容和技术路线

实验研究

第一章 Neu-p11对大鼠葡萄糖及肾上腺素性高血糖的调节作用研究

第二章 Neu-p11对高脂饲料喂养的慢性应激大鼠糖脂代谢影响的药效学研究

第三章 Neu-p11对高脂饲料喂养的慢性应激大鼠糖脂代谢影响的相关机制研究

第四章 开心散、当归芍药散和圣约翰草对高脂饲料喂养的慢性应激大鼠糖脂代谢影响的药效学比较

第五章 当归芍药散对高脂饲料喂养的慢性应激大鼠糖脂代谢的影响

第六章 当归芍药散对高脂饲料喂养的慢性应激大鼠糖脂代谢影响的相关机制研究

结语

1.研究结论

2.研究结果的意义

3.问题与展望

参考文献

附录

致谢

在学期间主要研究成果