抗真菌肽基因AFP的克隆和植物表达载体的构建及牧草遗传转化的研究

摘要

真菌病害是限制牧草生长的主要因素之一,每年由于真菌病害给牧草和草坪草带来了很大的经济损失.造成牧草产量下降,品质变劣;草坪草褪色、黄化甚至枯死,影响草坪质量降低利用年限.传统的对真菌防治方法采用施用杀菌剂和农药,这会带来环境的污染,危害人类的身体健康.而基因工程技术的兴起,为我们提供了新的研究方法.本研究采用RT-PCR方法,从萝卜叶片中提取总RNA进行反转录得到cDNA,通过设计PCR扩增特异,克隆得到抗真菌肽(antifungal protein)基因,与pUC<,m>-T easy vector连接,转化E.coli DH5 α,得到重组子pUC<,m>AFP,经酶切和序列分析鉴定,改片段分子大小为240bp,通过序列对比分析发现与genebank中已发表的AFP碱基序列一致,有100.00﹪的同源性,将其序列翻译成蛋白没有终止子的出现,表明可以进行原核表达和植物载体转化实验.将此抗真菌肽基因克隆到E.coli表达载体pET28a,在IPTG的诱导下表达出含有AFP的11.99 OD,证明该AFP基因在原核表达系统中可以正常表达.从水稻叶片中提取基因组DNA,设计PCR扩增特异引物,克隆单子叶特异表达启动子Actinl基因,与pUC<,m>-T easy vector连接,转化E.coli DH5 α,得到重组子pUC<,m>Act,经酶切和序列分析鉴定,该片段分子大小为1238bp,通过序列对比分析发现与己发表的Actinl碱基序列有99.60﹪的同源性.构建Actinl启动子基因驱动的AFP基因单子叶植物表达载体,进行早熟禾的遗传转化;将AFP基因插入载体pBI121构建了双子叶植物表达载体,进行苜蓿的遗传转化,得到卡那霉素抗性初步筛选的转化苗.为深入开展草业抗真菌转基因研究奠定了基础.

目录

文摘

英文文摘

Ⅰ前言

Ⅱ文献综述

2.1牧草病害现状

2.2基因工程在草业抗病育种中的应用现状

2.2.1草业抗病基因工程

2.2.2草业抗虫基因工程

2.2.3草业抗除草剂基因工程

2.2.4草抗逆基因工程

2.2.5其它基因工程(高产，品质改良等)

2.3抗菌肽基因的研究及其应用

2.3.1抗菌肽的发现

2.3.2抗菌肽的作用机理

2.4提高牧草和草坪草抗真菌病的基因工程

2.4.1基因的选择

2.4.2启动子的选择

2.5遗传转化方

2.5.1农杆菌介导法

2.5.2外源基因直接导入法

Ⅲ实验部分

3.1启动子Actin基因的克隆

3.1.1材料

3.1.2方法

3.1.3结果与分析

3.2萝卜抗真菌肽AFP基因的克隆

3.2.1材料

3.2.2方法

3.2.3结果与分析

3.3 AFP基因在微生物中的表达鉴定

3.3.1材料

3.3.2方法

3.3.3结果与分析

3.4萝卜抗菌肽基因的抗菌功能实验

3.4.1菌种

3.4.2真菌培养基

3.4.3致病菌抑菌实验基本步骤

3.4.4结果与分析

3.5植物表达载体的构建

3.5.1材料

3.5.2方法

3.5.3结果与分析

3.6苜蓿的遗传与转化

3.6.1植物无菌外植体的获得

3.6.2农杆菌介导法

3.6.3基因枪转化外源基因

3.6.4结果与分析

Ⅳ讨论与结果

4.1讨论

4.2结论

参考文献

致谢

附图