培养条件对赫氏颗石藻(Emiliania huxleyi)生长及神经酰胺积累的影响

摘要

神经酰胺(ceramide)作为鞘脂类代谢的重要中间产物，参与细胞分化、增殖、信号转导、免疫、凋亡及衰老等重要生命活动，在食品、医药和化工（特别是高档护肤品）等领域有广泛的应用前景。作为信号分子的神经酰胺，在细胞中含量通常极低。目前国内外市场的神经酰胺主要来源于大米、小麦、玉米和魔芋等植物，含量仅占生物量干重的0.01％-0.2％，因此，天然神经酰胺产量较低是制约神经酰胺功能性产品开发的瓶颈。目前已从海洋动物中分离获得高生物活性的神经酰胺。与海洋动物和陆生植物相比，微藻易于兼、异养化培养、生长周期短、细胞中总脂含量较高，有望实现高密度发酵生产活性物质。赫氏颗石藻Emiliania huxleyi神经酰胺具有自然界罕见的特殊结构且其生物学活性较高。目前，赫氏颗石藻细胞培养密度偏低、总脂含量相对较低是制约其脂质神经酰胺产业化的主要因素。因此，如何有效提高赫氏颗石藻生物量及细胞总脂和神经酰胺的合成水平是赫氏颗石藻神经酰胺资源开发利用的关键。传统的培养方式（自养）生物量不高，而兼、异养培养不仅可以摆脱对光的依赖而且其生物量可大大提高。因此，营养方式的改变（如兼养和异养）是实现微藻高密度培养的一条有效途径，而且兼养或异养更有利于调控细胞内活性物质的积累。目前，赫氏颗石藻能否兼养或异养、兼养或异养条件下是否有利于生物量的提高及神经酰胺的积累、如何在较低成本下优化培养条件以获得较高的神经酰胺产量等研究尚未见报道。
　　本论文以赫氏颗石藻F.huxleyi BOF92为研究对象，利用微藻兼养、异养培养技术并结合其生长及神经酰胺合成途径，研究其兼养和异养特性，在此基础上进一步优化营养和环境条件，提高单位体积藻液中细胞的密度和单个细胞中总脂和神经酰胺的积累水平，达到细胞密度和目标物质积累双重提高功效，为赫氏颗石藻神经酰胺的产业化技术提供依据。主要研究结果如下:
　　1.有机营养种类和浓度对赫氏颗石藻生长的影响:赫氏颗石藻不具备化能异养和光异养生长的能力，具有光激活异养生长能力，但光激活异养条件下的生物量低于自养条件;赫氏颗石藻可行兼养营养，在50mM甘氨酸兼养下的最大细胞密度为自养条件下的1.43倍，而在5mM丝氨酸兼养下的最大细胞密度是自养条件下的1.6倍。
　　2.赫氏颗石藻在不同营养方式下的细胞内生化组分存在差异:甘氨酸兼养条件下，细胞中蛋白质的含量比自养条件下显著增加了1.56倍，而碳水化合物的含量仅为自养条件下的69.6％;不同营养方式下细胞色素含量存在显著差异，兼养条件下叶绿素a和叶绿素c分别是自养条件下的1.43倍和2.58倍，而类胡萝卜素的含量仅为自养条件下的13.04％;总脂在细胞中的含量差异不显著，自养和兼养下分别为15.97pg·cell-1和16.42pg·cell-1。
　　3.建立了蒸发光散射检测器-高效液相色谱(ELSD-HPLC)法检测赫氏颗石藻细胞中神经酰胺含量。自养和甘氨酸兼养方式下，藻细胞中总脂和神经酰胺含量随着细胞的生长逐渐积累，稳定期后期达到最高，两种营养方式下藻细胞中总脂和神经酰胺的含量差别不大;兼养条件下细胞密度可达到6.29×106cells·mL-1，是自养条件下的1.43倍，从而使单位培养体积中神经酰胺的含量显著增加到393.5μg·L-1，是自养条件下的1.38倍。
　　4.建立了尼罗红快速检测赫氏颗石藻细胞内脂类的方法:激发波长为491nm，发射波长为555nm，DMSO体积分数为45％、预处理温度为37.5℃、尼罗红染色浓度为1.6μg·mL-1、藻细胞浓度为(1.6-1.9)×104cells·mL-1;荧光显微镜下观察细胞内脂滴主要分布于细胞膜周围。
　　5.在f/2培养基基础上，通过单因素实验和响应面设计(RSM)，筛选出最佳营养组合为0.011mM Fe3++3mM NaHCO3+5mM Serine，优化培养条件为:光照强度为20μmol·m-2·s-1、初始接种细胞密度为4.5×105cells·mL-1、采用分批培养方式培养4-5天后可采收，细胞密度可达到7.3×106cells·mL-1，总脂和神经酰胺产量分别为16.02mg·L-1和0.454mg·L-1，占生物量干重比例分别为31.83％和0.895％(其中神经酰胺占总脂的2.81％)，单位培养体积的神经酰胺产量是对照的1.59倍。本研究结果为实现赫氏颗石藻神经酰胺的发酵法产业化生产、获得源于海洋微藻新型高活性天然神经酰胺奠定了基础。

目录

声明

摘要

主要符号表

1．1．1 神经酰胺的结构

1．1．2 神经酰胺的生物学功能

1．1．3 神经酰胺的生物合成

1．1．4 神经酰胺的应用前景

1．1．5 神经酰胺的主要来源

1．2 赫氏颗石藻(Emiliania huxleyi)制备神经酰胺

1．2．1 赫氏颗石藻简介

1．2．2 赫氏颗石藻制备神经酰胺的优势

1．3 微藻的营养方式

1．3．1 微藻三种营养方式的概述

1．3．2 不同营养方式下微藻的生长特征

1．3．3 不同营养方式下微藻生理生化代谢特征

1．4 微藻的生长条件与脂类合成

1．4．1 微藻的营养条件与脂类合成

1．4．2 微藻的培养环境与脂类合成

1．5 本论文研究的目的及主要内容

第2章 赫氏颗石藻自养、兼养和异养的特性研究

2．1 材料与方法

2．1．1 实验藻株及培养

2．1．2 实验主要试剂

2．1．3 不同营养方式下赫氏颗石藻的生长特征

2．1．4 不同营养方式下赫氏颗石藻细胞内的生化组分

2．1．5 不同营养方式下赫氏颗石藻细胞内神经酰胺的含量

2．2 实验结果

2．2．1 赫氏颗石藻的兼养生长特征

2．2．2 赫氏颗石藻异养生长特征

2．2．3 不同营养方式下赫氏颗石藻细胞内生化组分的变化

2．2．4 赫氏颗石藻神经酰胺检测方法的建立

2．2．5 不同营养方式下赫氏颗石藻神经酰胺含量的变化

2．3 分析与讨论

2．3．1 赫氏颗石藻利用有机营养进行兼养和异养具有选择性

2．3．2 兼养改变赫氏颗石藻细胞内的生化组分

2．3．3 自养和兼养条件下赫氏颗石藻总脂积累与神经酰胺含量之间的关系

2．4 本章小结

第3章 赫氏颗石藻脂质相对含量快速检测方法的建立

3．1 材料与方法

3．1．1 实验主要试剂

3．1．2 藻种与培养

3．1．3 赫氏颗石藻细胞经尼罗红染色后的荧光强度分析

3．1．4 尼罗红染色赫氏颗石藻的荧光显微观察

3．2 实验结果

3．2．1 条件优化

3．2．2 赫氏颗石藻细胞中脂质的分布

3．3 分析与讨论

3．4 本章小结

第4章 不同营养条件对赫氏颗石藻生长及神经酰胺积累的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 实验主要试剂

4．1．2 藻种与培养

4．1．3 单因素试验

4．1．4 响应面试验设计

4．1．5 最佳营养组合下其他培养条件的优化

4．1．6 不同营养方式下赫氏颗石藻的细胞超微结构

4．2 实验结果

4．2．1 单因素实验结果

4．2．2 筛选显著因子

4．2．3 响应面试验设计的结果

4．2．4 最佳营养组合下的不同培养条件的优化

4．2．5 最佳培养条件下赫氏颗石藻细胞超微结构的变化

4．3 分析和讨论

4．4 本章小结

第5章 结论与展望

5．1 本论文的主要结论

5．2 本论文创新点

5．3 本论文的研究展望

致谢

参考文献

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