日本鳗鲡Caspase6基因的克隆和表达分析

摘要

本研究首次获得了日本鳗鲡(Anguilla japonica)Caspase6基因cDNA全长序列，命名为AjCasp6（GenBank号KJ726738）。该基因全长为1524bp，其中开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)为903bp，编码300个氨基酸。其蛋白三维空间结构图与人类Caspase6十分相似，具有Caspase家族典型的CASc结构域，包括一个P20结构域(54aa-178aa)和一个P10结构域(204aa-298aa)，半胱氨酸活性位点“KPKIFIFQACRG”及组氨酸活性位点“HADADCFVCVFLSHG”。同源性分析显示AjCasp6氨基酸序列与虹鳟（Oncorhynchus mykiss）相似性最高，为75％，与其他鱼类相似性在61％～75％之间。系统发育树表明，AjCasp6与其他鱼类Caspase6聚为一支，而哺乳类以及两栖类Caspase6聚为一支。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明:AjCasp6基因在日本鳗鲡各组织中均有表达，其中鳃中表达量最高，肠、肝脏、肾脏、皮肤和血细胞中也有较高表达，而心脏和肌肉中的表达水平则相对较低。
　　日本鳗鲡经LPS、poly I:C和嗜水气单胞菌（A.hydrophila）刺激后，对其肾脏、肝脏、脾脏以及血细胞中AjCasp6基因在不同时相的表达变化进行了研究。结果表明:经LPS刺激后，AjCasp6基因在肝脏、肾脏和脾脏中的表达水平均有明显升高，而血细胞中表达量仅在3h有所升高，但6h则显著降低;poly I:C免疫注射后，肾脏、肝脏和脾脏中AjCasp6的表达量均有显著升高，而血细胞发现在6h显著下降，12h表达量略有升高;嗜水气单胞菌感染后，AjCasp6基因表达量在肾脏和肝脏显著上升，但在脾脏和血细胞中的表达量仅在6h和48h有所提高。
　　研究了日本鳗鲡肝脏细胞经LPS、poly I:C、CpG、PGN以及三种不同浓度嗜水气单胞菌刺激后的AjCasp6基因表达水平变化，结果表明:肝脏细胞经LPS、poly I:C和PGN刺激后，AjCasp6基因表达水平均有显著升高，而经CpG处理48h后AjCasp6表达量显著降低。经浓度分别为106cfu/mL、107cfu/mL以及108cfu/mL的嗜水气单胞菌感染后，AjCasp6表达量均有显著提高，其表达量与菌体浓度的增加呈正相关。
　　进行了日本鳗鲡AjCasp6基因原核表达及其兔抗血清的制备，结果表明:构建的重组载体pGEX-4T-2-AjCasp6可以在大肠杆菌中高效表达，重组蛋白的分子量约为60kDa，其表达量随着诱导时间的延长而提高，经镍柱亲和层析后获得高纯度的AjCasp6重组蛋白，制备相应的兔抗血清经ELISA检测其效价高达52100。
　　日本鳗鲡肝脏组织通过原代培养成功使细胞从组织块中迁出，且至传代培养中获得的肝脏细胞经多次传代以后细胞形态、增殖周期渐渐稳定。由于日本鳗鲡肝脏细胞独特的生长特性，因此其可以较长时间处于生长的平台期，在不更换培养液的情况下能够维持一个月而不至于大批细胞凋亡、解体，使用时直接消化传代即可用于后续实验。
　　构建了日本鳗鲡AjCasp6绿色荧光融合蛋白表达载体pEGFP-N1-AjCasp6，通过转染HEK-293T细胞对该蛋白的细胞定位进行了研究。结果表明，AjCasp6蛋白仅在细胞质中有所分布，作为对照的pEGFP-N1空载体转染HEK-293T细胞后，绿色荧光蛋白在细胞核和细胞质中均有表达，提示AjCasp6主要在细胞质中参与细胞凋亡进程的调控作用。

目录

声明

摘要

第1章 引言

1．1 Caspase基因在鱼类中的研究进展

1．2 研究的目的和意义

1．3 主要研究内容和技术路线

1．3．1 主要研究内容

1．3．2 技术路线

2．1 材料

2．1．1 实验动物以及菌株

2．1．2 仪器设备

2．1．3 试剂及其试剂配制

2．1．4 引物

2．2 方法

2．2．2 cDNA第一条链的合成及目的基因片段的获取

2．2．3 SMART-RACE技术获取目的基因全长

2．2．4 目的基因片段的割胶纯化

2．2．5 DNA与质粒载体的连接

2．2．6 感受态细胞的制备

2．2．7 感受态细胞的转化及筛选

2．2．8 质粒插入片段的检测

2．2．9 重组质粒测序和质粒提取

2．2．10 细胞转染重组表达载体的构建

2．2．11 原核重组表达载体的构建及鉴定

2．2．12 重组蛋白的表达纯化与复性

2．2．13 利用纯化蛋白制备多克隆抗体

2．2．14 酶联免疫分析(间接ELISA法)

2．2．15 HEK-293T细胞的复苏与培养

2．2．16 AjCasp6基因在细胞中的定位

2．2．17 日本鳗鲡肝脏和脾脏细胞的培养

2．2．18 日本鳗鲡细胞系的冻存与复苏

2．2．19 日本鳗鲡各组织及肝脏和脾脏细胞中表达

2．2．20 目的基因的生物信息学分析

2．2．21 数据获取处理与分析

第3章 结果

3．1 日本鳗鲡各组织总RNA的提取结果

3．3 AjCasp6基因序列分析

3．3．1 AjCasp6的cDNA序列分析

3．3．2 AjCasp6其他物种Caspase6多重比分析

3．3．3 AjCasp6其他物种Caspase6系统进化树分析

3．3．4 日本鳗鲡的AjCasp6的空间结构模拟

3．4 AjCasp6基因在体内和体外表达分析

3．4．1 AjCasp6基因在日本鳗鲡各组织中表达分析

3．4．2 AjCasp6基因在肝脏细胞系中的表达变化

3．5 原核表达及其检测

3．5．1 原核重组表达载体的构建结果

3．5．2 重组载体的原核表达结果及检测

3．6 AjCasp6蛋白的间接ELISA特异性实验结果

3．7 日本鳗鲡肝脏细胞系的原代培养和传代培养

3．7．1 日本鳗鲡肝脏细胞系的原代培养

3．7．2 日本鳗鲡肝脏细胞系的传代培养

3．8 不同传代比例对JEL增殖曲线的影响及群体倍增时间分析

3．9 AjCasp6基因在人类293细胞系中的转染和定位

3．9．1 AjCasp6基因在人类293细胞系中的转染

3．9．2 AjCasp6基因在人类293细胞系中的亚细胞定位

第4章 讨论

第5章 结论和展望

致谢

参考文献

在学期间科研成果情况