灵芝孢子油的化学成分和抗肿瘤活性的研究

摘要

灵芝孢子油为灵芝孢子粉经干燥、破壁、超临界二氧化碳萃取工艺制得的提取物，目前灵芝孢子油的市售产品主打提高免疫及抗肿瘤的作用，药理实验研究也表明灵芝孢子油具有抗肿瘤、提高免疫、保肝护肝、抗氧化等活性。但是灵芝中可作为其有效成分的三萜及多糖类在灵芝孢子油中含量较低，无法对灵芝孢子油的品质作出科学有效的评价，因此寻找灵芝孢子油的有效成分对灵芝孢子油质量控制的研究至关重要。本文拟从灵芝孢子油的不皂化物（主要为甾体类）成分入手研究灵芝孢子油的活性成分，主要研究内容分为以下几个方面: 一、灵芝孢子油皂化条件考察 采用单因素实验分别考察灵芝孢子油皂化碱浓度、皂化碱量、皂化时间、皂化温度，结合实验结果及实际可操作性，确定其皂化方法为皂化碱浓度1mol/L，每克灵芝孢子油皂化碱量0.22g，皂化时间1.5h，皂化温度80℃。 二、灵芝孢子油不皂化物的分离纯化及结构鉴定 采用硅胶柱层析与制备型高效液相色谱相结合，对灵芝孢子油不皂化物(UMGSO)进行分离纯化，得到8个化合物，利用波谱学手段、理化性质及相关文献报道数据对照鉴定了各化合物，结构分别为:(22E，24R)-麦角甾-7，22-二烯-3β-醇(1)、麦角甾-7-烯-3β-醇(2)、麦角甾-4，6，8(14)，22-四烯-3-酮(3)，β-谷甾醇(4)、异岩藻甾醇(5)、麦角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇(6)、麦角甾-7，22-二烯-3β，5α，6α-三醇(7)、5α，6α-环氧-(22E，24R)-麦角甾-8(14)，22-二烯-3β，7α-二醇(8)。其中化合物2、4、6、7为首次从灵芝孢子油中分离得到，化合物5、8为首次从灵芝中分离得到。 三、灵芝孢子油不皂化物抗肿瘤活性初步研究 1.UMGSO对S-180荷瘤小鼠的抑瘤作用 研究UMGSO对S-180荷瘤小鼠的抑瘤作用，结果表明高(700mg/kg)、中(140mg/kg)剂量组UMGSO对小鼠肿瘤生长具有显著的抑制作用(p＜0.05)，与阴性对照组相比，其抑瘤率分别为45.09％、43.40％，而且各剂量组UMGSO对小鼠脾脏指数没有影响。 2.UMGSO对HepG2、MCF-7细胞生长的影响 采用MTT法检测UMGSO对人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响，结果表明:UMGSO对两种肿瘤细胞均有明显的生长抑制作用，且呈剂量依赖性，其IC50分别为14.5μg/mL及16.8μg/mL。 以上实验表明:UMGSO在灵芝孢子油的抗肿瘤疗效中发挥着重要作用。 四、灵芝孢子油中麦角甾-4，6，8(14)，22-四烯-3-酮的含量测定研究 麦角甾-4，6，8(14)，22-四烯-3-酮(EG)是UMGSO主要甾体成分之一，现有研究证明其能够抑制多种肿瘤细胞的增殖[38-40]，且EG为菌类植物油的特有成分，与总三萜、脂肪酸、麦角甾醇等质量控制指标相比更具有特征性。因此本章对灵芝孢子油中EG的含量进行研究，采用YMC-Pack ODS-A色谱柱，以纯甲醇为流动相，柱温30℃，流速1mL·min-1，检测波长350nm，建立高效液相色谱法测定灵芝孢子油中EG的含量。结果表明EG在1.39～33.34μg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系(r=1)，平均加样回收率(n=6)为100.70％(RSD=0.75％)。由于该方法稳定，准确，重复性好，可用于灵芝孢子油中EG的含量测定。

目录

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摘要

前言

第一章 灵芝孢子油皂化条件的优化

1 实验仪器与材料

1．1 仪器

1．2 试药

2 实验方法

2．1 色谱条件

2．2 灵芝孢子油样品溶液的制备

2．3 灵芝孢子油不皂化物供试品溶液的制备

2．4 灵芝孢子油荧光斑点得率的计算

2．5 灵芝孢子油皂化率的测定

2．6 灵芝孢子油皂化值的测定

2．7 灵芝孢子油皂化条件考察

2．8 验证实验

3 结果与分析

3．1 灵芝孢子油皂化值的测定

3．2 灵芝孢子油皂化条件考察

3．3 灵芝孢子油皂化方法的验证

4 讨论

5 小结

第二章 灵芝孢子油不皂化物的分离纯化及结构鉴定

1 实验仪器与材料

1．1 仪器

1．2 试药

2 灵芝孢子油不皂化物的分离纯化

2．1 灵芝孢子油不皂化物的制备及分离纯化

2．2 提取分离流程图

3 结构鉴定结果及分析

3．1 化合物1结构鉴定结果及分析

3．2 化合物2结构鉴定结果及分析

3．3 化合物3结构鉴定结果及分析

3．4 化合物4结构鉴定结果及分析

3．5 化合物5结构鉴定结果及分析

3．6 化合物6结构鉴定结果及分析

3．7 化合物7结构鉴定结果及分析

3．8 化合物8结构鉴定结果及分析

4 小结

第三章 灵芝孢子油不皂化物抗肿瘤活性初步研究

第一节 UMGSO对S-180荷瘤小鼠的抑瘤作用

1 实验材料

2 实验方法

3 结果及分析

4 小结

第二节 UMGSO对HepG2、MCF-7细胞生长的影响

1 实验仪器与材料

2 实验方法

3 结果及分析

4 小结

第四章 灵芝孢子油中EG的定性分析及含量测定

1 仪器与试药

1．1 仪器

1．2 试药

2 灵芝孢子油中EG的定性分析

2．1 HPLC-ESI-MS定性分析方法

2．2 对照品溶液及样品溶液定性分析结果

3 HPLC法测定灵芝孢子油中EG的含量

3．1 实验方法

3．2 方法学考察

3．3 样品测定结果

4 讨论

5 小结

结论

参考文献

致谢

附录

文献综述 灵芝孢子油的研究进展

作者简历