基于TGF--β1信号通路探究乙肝病毒感染后瘀证患者病情进展的机制

摘要

目的:基于TGF-β1信号通路探究感染乙肝病毒以后血瘀证患者病情由CHB发展至HBC乃至HCC的疾病进展机制。 方法:本课题在文献研习以及既往研究的基础上，选择TGF-β1信号通路作为目标通路，通过对2例（血瘀证和脾虚证各1例）HBC发展至HCC患者的同一患者二个疾病阶段的血清进行蛋白细胞因子芯片以及各20对CHB、HBC和HCC血瘀证和脾虚证患者血清进行代谢组学筛选复核比对，再进行定点蛋白和候选Micro检测。 结果:1.蛋白芯片的细胞因子筛选发现了TGF-β1在血瘀证HCC患者较其HBC阶段呈92.56的上调表达，列细胞因子表达的第一位，远远高于脾虚证患者的20.1，提示TGF-β1可能不仅在疾病进展中扮演重要角色，同时与血瘀证密切相关，证实目标通路的TGF-β1可以作为定点目标蛋白，且能调控INFγ的表达。2.代谢组学研究筛选出血瘀证的差异性物质也与TGF-β1的异常表达相匹配，进一步对目标通路进行复核证实;3.蛋白细胞因子表达验证提示血清中TGF-β1的蛋白表达以及TGF-β1/INFγ值，HCC＞HBC＞CHB＞Normal(p＜0.01)。INFγ的蛋白表达则下调HCC＜HBC＜CHB＜Normal(p＜0.01)。以上结果由于数据方差不齐，均采用秩和检验。TGF-β1/INFγ结果趋势同TGF-β1，由于通过方差齐性检验采用LSD-t检验表现出更好的趋向性上调表达(p＜0.01)。至于血瘀证与脾虚证患者的TGF-β1、INFγ、TGF-β1/INFγ都匹配疾病进展(p＜0.01)，其中总血瘀证与总脾虚证比较，以及每个疾病间的血瘀证与脾虚证之间的比较都有显著性差(p＜0.01)。4.Micro检测:选择的Micro也是与TGF-β1信号通路密切相关，其中hsa-miR-21-5p在疾病三个阶段患者较正常组都具有显著差异(P＜0.01);CHB患者表达上调最明显，与HBC和HCC患者相比，也有显著差异(P＜0.01)。hsa-miR-146a-5pCHB和HBC阶段患者与正常人相比，有差异(P＜0.05)，CHB患者表达上调与HCC患者相比也有差异(P＜0.05)，同时HBC与HCC患者相比，差异显著(P＜0.01)。hsa-miR-29b-3pHCC与正常组有显著差异(P＜0.01)，表达明显下调且与HBC有显著差异(P＜0.01)和HBC亦有差异(P＜0.05)。至于血瘀证与脾虚证CHB与HCC阶段无差异，在HCC阶段hsa-miR-21-5p血瘀证和脾虚证具有显著差异(P＜0.01);hsa-miR-146a-5p血瘀证和脾虚证患者之间也有显著差异(P＜0.01)。 结论:基于蛋白芯片、代谢组学复核以及定点蛋白和Micro技术验证我们发现乙肝病毒感染后血瘀证患者病情进展与TGF-β1信号通路中蛋白和基因表达异常有关。而hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-21-5p可能可以作为血瘀证的判别指标。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 基于目标TGF-β1信号通路蛋白芯片技术筛选复核

1 病例选择

1．1 诊断标准

1．2 病例信息

2 样品采集及处理

2．1 样品准备

2．2 芯片杂交

3 扫描结果

3．1 扫描结果

3．2 芯片数据结果

4 讨论

4．1 蛋白细胞因子芯片技术

4．2 血瘀证备选蛋白TGF-β1和IFN-γ

5 结论

第二部分 基于基于目标TGF-β1信号通路代谢组学筛选复核

1 病例选择

1．1 病例来源

1．2 样本量估算

1．3 诊断标准

1．4 资料录入

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

3．1 临床资料

3．2 血瘀证和脾虚证血清代谢图谱与差异物质分析

4 讨论

4．1 代谢组学技术在证侯研究中的运用

4．2 血瘀证差异物质和代谢通路分析和舌下脉络在血瘀证中的诊断价值

5 结论

第三部分 三个疾病阶段血瘀证与脾虚证患者细胞因子蛋白表达验证

1 病例选择

1．1 病例来源

1．2 样本量估算

1．3 诊断标准

1．4 资料录入

2 材料与方法

2．1 细胞因子TGF-β1检测

2．2 细胞因子IFN-γ检测

3 统计方法

4 结果

4．1 不同疾病间TGFβ1、INFγ、TGFβ1／INFγ比较

4．2 血瘀证与脾虚证间TGFβ1、INFγ、TGFβ1／INFγ比较

4．3 不同疾病的血瘀证间TGFβ1、INFγ、TGFβ1／INFγ比较

4．4 不同疾病的脾虚证间TGFβ1、INFγ、TGFβ1／INFγ比较

4．5 CHB血瘀证与脾虚证间TGFβ1、INFγ、TGFβ1／INF比较

4．6 HBC血瘀证与脾虚证间TGFβ1、INFγ、TGFβ1／INF比较

4．7 HCC血瘀证与脾虚证间TGFβ1、INFγ、TGFβ1／INF比较

5 讨论

5．1 TGF-β1与肝病

5．2 IFNγ与肝病

5．3 TGF-β1与IFNγ

5．4 血瘀证与TGF-β1、IFNγ和TGF-β1／IFNγ

6 结论

第四部分 三个疾病阶段血瘀证与脾虚证患者MicroRNA验证研究

1 病例选择

1．1 病例来源

1．2 样本量估算

1．3 诊断标准

1．4 资料录入

2 材料与方法

2．1 血清RNA的抽提

2．2 cDNA合成

2．3 实时定量PCR

3 计算数据

3．1 实时定量PCR使用引物列表

3．2 检测数据

3．3 熔解曲线及扩增曲线图

4 统计方法

5 结果

5．1 三个疾病阶段hsa-miR-21-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-29b-3p表达比较

5．2 三个疾病总的血瘀证和脾虚证hsa-miR-21-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-29b-3p表达比较

5．3 三个疾病血瘀证hsa-miR-21-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-29b-3p表达比较

5．4 三个疾病脾虚证hsa-miR-21-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-29b-3p表达比较

5．5 CHB血瘀证与脾虚证hsa-miR-21-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-29b-3p表达比较

5．6 HBC血瘀证与脾虚证hsa-miR-21-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-29b-3p表达比较

5．7 HCC血瘀证与脾虚证hsa-miR-21-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-29b-3p表达比较

6 讨论

6．1 miRNA检测技术在证候研究中的运用

6．2 TGF-β相关的MicroRNA

6．3 TGF-β相关的MicroRNA与血瘀证

7 结论

结论

参考文献

附件1

附件2 慢性乙型肝炎防治指南

附件3

附件4

致谢

文献综述

作者简历