抗原特異的T細胞検出のための一細胞レベル細胞間相互作用解析デバイスの開発

摘要

ウイルスやがh細胞などから生体を守る免疫応答の開始には、抗原提示細胞(APC）が提示する疾病の情報である抗原をT細胞受容体(TCR)により特異的に認識する必要がある。TCRは、あらゆる抗原に対応するために各々で異なっており[1]、免疫応答を惹起する抗原特異的T細胞の検出には一細胞レベルでの解析が不可欠であるが、そのような解析手法は未だ確立されていない。そこで本研究では、流路中央部にΦ5mm開口部を有する、アレイ状に配置したΦ15μm、深さ15μmのマイクロウェルと高さ25μmの堰を組み合わせた構造にてT細胞／APCの細胞対をシングルセルレベルで形成させるマイクロ流体デバイスを独自開発した[2]。作製したデバイスを用いて、APCとの相互作用に伴うT細胞Ca2+濃度変化測定とT細胞遺伝子発現との相関性の紐づけを試みた。フォトリソグラフィ技術によりデバイスを設計製作し、スライドガラス上に生体適合性が高く自家蛍光の少ないPDMSを材料にデバイスを作製した。アレイ状に配置した微細構造にAPCを一細胞補足し、T細胞を灌流させAPCに接触させることでT細胞とAPCの相互作用を促した。実験には、モデル系として遺伝子改変マウス及び野生型マウス由来のT細胞、APCを用いた。T細胞がAPCに接触した時点で相互作用が開始したと仮定し、Ca2+インジケーターであるFluo4-AMによりT細胞Ca2+変化を経時的に蛍光測定した。得られた蛍光強度を正規化し、T細胞Ca2+濃度の時間変化を指標にT細胞活性を評価した。特異ペアのT細胞では持続的に高い蛍光強度が測定された一方、非特異ペアでは細胞同士の接触後に一時的な蛍光強度ピークが測定された。T細胞Ca2+シグナル測定から3時間インキュベート後、マイクロマニピュレーターを用いてデバイスより一細胞毎に回収し、シングルセルRNA-Seqにより発現遺伝子を解析した。R/BioconductorパッケージのedgeRにより特異／非特異ペア間で発現変動遺伝子（DEG）を検出解析したところ、TCRによる抗原認識下流の免疫応答遺伝子群が確認された。また、統計的処理により持続的／短期的Ca2+シグナル活性T細胞の二群に分類し、DEG解析を行った。持続的Ca2+活性T細胞では、細胞代謝に関連する遺伝子発現が確認された一方、短期的Ca2+活性T細胞では、即時的な細胞傷害機能の遺伝子が発現していた。以上より、APCとの相互作用に伴うT細胞Ca2+濃度変化と、T細胞の免疫機能活性との相関性を紐づけることが可能であることが示唆された。