副猪嗜血杆菌免疫原性基因GAPDH的原核表达及蛋白纯化

摘要

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪的条件性致病菌,常引起以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎等为特征的格拉泽氏病,严重危害养殖业的发展.虽然抗生素对该病有一定的治疗效果,但长期使用也导致细菌耐药性越来越严重,因此疫苗仍然是控制该病的最佳手段.3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是HPS的一个外膜蛋白,可以促进B细胞和T细胞的增殖,具有重要的免疫调节作用,可以作为新型DNA疫苗的候选蛋白.本研究以副猪嗜血杆菌标准5型血清菌株的基因组DNA为模板,利用PCR技术克隆得到GAPDH片段,将其和原核表达载体pET28a都进行双酶切处理后,在T4连接酶的作用下连接得到重组质粒pET28a-GAPDH,经验证无误后,将其导入大肠杆菌BL21中,在IPTG的诱导下进行原核表达.结果表明,重组菌株可以在含有卡那霉素的LB平板上长出单菌落,菌液PCR可以扩增出1020bp大小的外源基因片段,说明GAPDH原核表达载体构建成功.通过SDS-PAGE实验可以看到,重组菌株BL21(pET28a-GAPDH)在IPTG的诱导下表达出带有His标签的,大小约为37KDa的3-磷酸甘油醛脱氢酶蛋白,与理论值相符,应用镍离子亲和交换柱进行蛋白的纯化,纯化后得到的蛋白含量约为0.988mg/mL,证明GAPDH基因可以在原核表达系统中得到有效表达且蛋白纯化后蛋白含量较高.