多维色谱-生物质谱分离鉴定平台及其在蛋白质组研究中的应用

摘要

蛋白质组学研究中双向凝胶电泳(2-DE)是应用最广泛的分离手段,近几年其应用比例逐渐下降,主要是因为2-DE分析酸性,碱性或疏水性强的蛋白能力有限,加之液相色谱质谱联用蛋白鉴定技术重现性和通量不断提高,以反相液相与质谱联合鉴定为基础联用技术已在蛋白质组学研究中取得优势地位.在已有的两维色谱系统中,采用离子交换和反相色谱(SCX-RPLC)分离的比例最高,因为这两种分离模式对于混合蛋白样品分离十分有利于质谱分析.然而,随着生物体组织全提蛋白分析,复杂程度不断提高,尤其在分析可含有几千个蛋白酶解后的样品,肽段数量达到数十万条.采用两维色谱分离难度很大.一个色谱峰里包含数十个肽段,由于质谱扫描速度的限制,同时流出肽段的信息将被损失掉,实际鉴定肽段数目明显减少.另外,高丰度肽信号压制低丰度肽质谱信号,也极不利于低丰度肽的鉴定.因此,在两维分离的基础上,增加第三维色谱分离以增加系统的分辨力.理论上,三维分离系统的峰容量和样品容量相对于二维系统会大大提高,对于中低丰度蛋白的鉴定非常有利. 在SCX-RPLC基础上增加第三种分离模式,对该分离模式选择须满足以下三个因素:1.对样品无歧视效应;2.各维分离机理正交;3.不同分离模式使用流动相兼容.为此,本研究建立了满足上述条件的三维分离分析平台,以体积排阻色谱(SEC)作为第一维,与SCX-RPLC联合组成三维分离系统.SEC能对分子量差别很大(几百至几十万道尔顿)的样品进行分离,流动相选择范围广(从酸性,中性直至碱性,水相或有机相皆可,还可加入变性剂或表面活性剂以增加样品溶解性),分离速度快,操作简单.为了增加分析的速度和通量,该系统还进一步采用了18通道RPLC系统的SCX-array-RPLC构建分离平台,并通过自动点样系统,将分离样品直接点样到质谱MALDI靶板上,进行质谱鉴定.该系统对肝脏蛋白质研究获得了数以千计的蛋白质鉴定结果.