Nrf2-ARE通路在离体鼠心缺血/乳化异氟醚后处理中作用的研究

摘要

目的:建立大鼠离体心脏血缺再灌注损伤模型,观察缺血/乳化异氟醚后处理对缺血再灌注损伤大鼠心脏功能的影响,并探讨Nrf2-ARE通路在缺血/乳化异氟醚后处理心肌保护机制中的作用.方法:1.建立Langendorff大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型:采用Langendorff灌注装置,将56只雄性SD大鼠随机分为正常组(NOR组)、缺血再灌注损伤组(CON组)、缺血后处理组(IPO组)、不同浓度的乳化异氟醚后处理组(0.84、1.68、2.52 mmol/L;EI1、EI2、E13组)、脂肪乳组(FAT组),每组8只.各组灌注方案:NOR组:平衡灌注Kerbs-Henseleit缓冲液(K-H液)20 min后,续灌100 min;CON组:平衡灌注20 min,灌注4℃ST.Thomas停跳液,全心缺血40 min,复灌K-H液60min;IPO组:平衡灌注20 min,全心缺血40min,再灌注前给予6次间隔有氧灌注10 s全心缺血10 s,续灌58 min;EI组:平衡灌注20 min,缺血40 min,再灌注前给予含不同浓度乳化异氟醚的K-H液2 min,续灌58 min;FAT组:平衡灌注20 min,缺血40 min,再灌注前给予含脂肪乳的K-H液2 min,续灌58 min.记录各组平衡末及灌注末的左室发展压(LVDP)、心率(HR)、左室舒张末压(LVEDP)、以及+dp/dtmax等心功能各指标的变化,并收集灌注末左室心肌组织.2.电镜观察心肌组织超微结构的变化及线粒体Flameng评分情况.3.采用Real-Time PCR和Western blotting方法,检测灌注末各组心肌组织中血红素加氧酶1(HO-1)、醌氧化还原酶(NQO1)、超氧化物歧化酶1(SOD1)及核因子相关因子-2(Nr2)基因mRNA转录及蛋白质表达的情况.结果:1.心功能指标:平衡末各组间心功能无明显差异(P＞0.05);续灌末,NOR组、IPO组、EI各浓度组及FAT组心功能显著优于CON组(P＜0.05),其中IPO组和EI2组心功能明显优于EI1组、EI3组和FAT组,IPO组和EI2组各项心功能指标无差异(P＞0.05);在HR和+dp/dtmax方面:EI1组、EI3组和FAT组之间无明显差异(P＞0.05);LVEDP:IPO组和EI2组明显低于EI1组、EI3和FAT组(P＜0.05),其中EI1组和EI3组低于FAT组,差异有统计学意义(P＜0.05).2.电镜观察心肌细胞超微结构和线粒体Flameng评分.2.1电镜观察心肌细胞超微结构:NOR组超微结构形态基本正常;CON组超微结构损伤最严重;IPO组和EI2组优于EI1组、EI3和FAT组,EI1组和EI3组优于FAT组.2.2线粒体Flameng评分:与NOR组相比,其余各组分数显著升高(P＜0.05),IPO组和EI2组分数明显低于EI1和EI3组(P＜0.05),EI1和EI3组低于FAT组(P＜0.05),FAT组分数较CON组低,但无统计学差异(P＞0.05).3.HO-1、NQO1、SOD1及Nrf2 mRNA表达量:与NOR组相比,其它各组HO-1、NQO1、SOD1及Nrf2基因mRNA表达量均显著降低(P＜0.05).与CON组相比,其余各组基因mRNA表达量显著增高(P＜0.05).IPO和EI2组在各组基因mRNA表达量比较,无显著差异(P＞0.05).HO-1及SOD1基因表达量在IPO及EI2组显著高于其余各组(P＜0.05);其中HO-1基因mRNA表达量在EI1组和EI3组高于FAT组(P＜0.05),EI1组和EI3组两者之间无显著差异(P＞0.05);SOD1基因mRNA表达量在EI1组、EI3组及FAT组三者之间比较差异无显著性(P＞0.05).NQO1和Nrf2基因mRNA表达量在IPO组及EI2、EI3组显著高于EI1、FAT组(P＜0.05);IPO组及EI2、EI3组三组之间无差异(P＞0.05);EI1组和FAT组之间无差异(P＞0.05).4.HO-1、NQO1、SOD1及Nrf2蛋白表达量:与NOR组相比,其它各组HO-1、NQO1、SOD1及Nrf2蛋白表达量均显著降低(P＜0.05).HO-1和Nrf2蛋白表达量在IPO和EI2组显著高于其余组(P＜0.05),EI1、EI3及FAT组蛋白表达量明显高于CON组(P＜0.05),且三组之间无显著差异(P＞0.05).SOD1蛋白表达量在IPO和EI2组显著高于其它组(P＜0.05),EI1和EI3组又明显高于CON组和FAT组(P＜0.05),EI1和EI3组之间及CON组和FAT组之间差异无统计学意义(P＞0.05).NQO1蛋白表达量在IPO组和EI各浓度药物后处理组显著高于CON组和FAT组(P＜0.05),IPO组和EI各浓度药物后处理组之间无显著差异(P＞0.05).结论:1.缺血、乳化异氟醚、脂肪乳后处理均能减轻缺血再灌注损伤,改善心脏功能,缺血、不同浓度乳化异氟醚较脂肪乳后处理具有更确切的心肌保护作用.其中,乳化异氟醚(1.68 mmol/L)后处理心肌保护作用与缺血后处理的心肌保护作用相当,优于乳化异氟醚其余浓度组.2.缺血、不同浓度乳化异氟醚、脂肪乳后处理均可上调Nrf2及其下游抗氧化蛋白和二相解毒酶基因及蛋白的表达,从而发挥心肌保护作用,激活Nrf2-ARE通路可能是后处理的心肌保护机制之一.