双Z结构域亲和层析柱的制备及稳定性研究

摘要

治疗性抗体是当前生物制药中发展最快、成果最显著的领域之一,国际上批准的治疗性抗体已经有24种,占生物技术药物产业份额的1/4～1/3,抗体的纯化和制备方法也因此受到了广泛的关注。其中,抗体纯化最常用的方法之一是固定蛋白质A的亲和层析法,蛋白质A(SPA)是金黄色葡萄球菌细胞壁的组成成分,它与抗体有很强的结合能力。但由于天然SPA提取及纯化较困难,使得相应的亲和层析柱制备成本很高,提高了抗体纯化的成本。Z结构域是SPA中的抗体结合结构域B经定点突变改造获得的,比天然SPA有更高的稳定性,将两个Z结构域串联形成的双Z结构域(ZZ)蛋白,与IgG结合容量同天然SPA分子的结合容量相似。通过基因工程的方法可以大量制备ZZ蛋白,降低生产成本。rn 前期工作中，以pET32a为载体，在原核表达系统表达了ZZ蛋白，利用ZZ融合蛋白上的His标签，通过镍柱可高效地纯化ZZ蛋白，将之偶联到琼脂糖上制备双Z结构域亲和柱，可有效地结合和纯化人IgG蛋白质。本文进一步研究偶联反应条件对亲和层析柱结合IgG能力的影响，并初步考察制备的亲和层析柱的稳定性。在碱性条件下，用环氧氯丙烷对琼脂糖载体进行活化，通过戊二醛法引入手臂，然后加入纯化的ZZ重组蛋白溶液，30℃振荡4h，用蒸馏水洗净；然后加入乙醇胺溶液，在室温下振荡2h，屏蔽未反应的环氧基团；后用一定浓度的牛血清白蛋白于室温反应2h，封闭未反应的醛基，最后用大量的蒸馏水洗净。本实验制备ZZ-Sepharose亲和层析柱具有较好的稳定性，循环使用7次，对人IgG的结合容量均能维持在14.Omg/mL填料以上，可用于人抗体的分离纯化。