日本脑炎病毒基因Ⅰ型和Ⅲ型复合RT-PCR鉴别方法的建立

摘要

为建立一种简单快捷的鉴别日本脑炎病毒(JEV)基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的方法,本研究根据基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV的保守序列,分别设计合成了针对基因Ⅰ型和Ⅲ型JEV的RT-PCR引物P1/P3和P2/P3,以JEV SA14-14-2和CZ1株的核酸提取液为模板,通过对反应体系及条件的优化,建立了一种可快速鉴别JEV基因Ⅰ型和Ⅲ型的复合RT-PCR方法,并利用建立的方法对27份临床样品进行了检测.结果显示,以设计合成的引物进行复合RT-PCR扩增,基因Ⅰ型JEV得到与预期相符的381bp的特异性条带,基因Ⅲ型JEV得到与预期相符的550bp的特异性条带,而对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒及猪伪狂犬病毒的核酸扩增结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV的最小检出量分别为2.0pg和20pg;利用建立的复合RT-PCR方法对27份临床样品检测结果显示其中5份为基因Ⅰ型,2份为Ⅲ型,与核苷酸序列分析结果一致.结果表明,建立的复合RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于检测及鉴别基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV.