脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对脑缺血再灌注大鼠微血管损伤的保护作用

摘要

目的：从脑缺血再灌注后不同时间点大鼠的神经功能、脑组织含水量、脑梗死面积、脑组织病理改变以及BBB通透性、微血管基底膜成分、明胶酶和纤溶酶系统等方面的动态变化，观察大鼠脑缺血再灌注后微血管损伤的特点，揭示其变化规律；通过脑脉通、MSCs移植及其联合应用对上述变化的影响及MSCs在大鼠脑组织内的存活及分化，评价其对脑缺血后微血管损伤的保护作用，并初步揭示其保护机制。rn 方法：采用青年SD大鼠，195只，雌雄各半，按随机数字表法进行二次随机分组：第一次根据处理因素分为假手术组和手术组，手术组包括模型组、脑脉通组、MSCs移植组、MSCs移植联合脑脉通组，假手术组为15只，其余各组45只大鼠：第二次对手术组根据取材时间点不同又分为7d、14d、28d组，每组每个时间点各15只。采用全骨髓贴壁培养筛选法进行体外MSCs的纯化、培养、增殖、Brdu标记和计数。术前4天脑脉通和联合组分别于给予脑脉通(40.5mg／100g／d，40.5mg／ml)灌胃，假手术组、模型组和移植组以同等体积的生理盐水灌胃，每日一次；灌胃第5天参照改良的Longa法用线栓阻塞大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血动物模型，术后3小时缓慢拔出栓线进行缺血后再灌注；再灌注后24小时移植组和联合组由颈内动脉给予MSCs悬浮液，模型组、脑脉通组颈内动脉给予和MSCs移植组同等体积的生理盐水；移植后脑脉通和联合组大鼠分别给予脑脉通灌胃，模型组和移植组大鼠给予同等体积的生理盐水灌胃。观察各组大鼠的神经功能评分、脑含水量、脑梗塞面积、脑组织病理改变，采用免疫组织化学方法观察脑组织内IgG、Ⅳ型胶原、LN、明胶酶系统(MMP-9、TIMP-1)和纤溶酶系统(t-PA、PAI-1)的表达以及脑组织内Brdu标记细胞数量、Brdu／FⅧ双标细胞数量与FⅧ分化率。rn 结果：rn ①模型组大鼠较假手术组死亡率显著增高，体重变化率极显著增加，神经功能评分极显著降低，脑组织含水量极显著上升，脑梗塞面积极显著增大，光电镜病理观察假手术组未见明显病理损伤，模型组大鼠脑组织可见不同程度的病理损伤和微血管破坏；rn 治疗组较模型组大鼠7d体重下降率显著减少，14d、28d体重增加率显著增多，神经功能评分极显著增高，脑组织含水量显著降低，脑梗塞面积显著减小，脑组织病理损伤和微血管破坏减轻；与脑脉通组和移植组比较，联合组作用尤为显著，且以28d组最为明显；随着缺血再灌注时间的延长，大鼠神经功能损伤以7d最为严重，其后逐渐恢复；脑组织含水量及脑梗塞面积则以14d最为严重，28d有所减轻，微血管结构破坏，以14d最为严重，至28d仍维持在一个较高的水平。rn ②模型组大鼠较假手术组IgG表达极显著增强，IV型胶原和LN表达显著降低；治疗组较模型组IgG表达极显著降低，IV型胶原及LN表达极显著增高；联合28d组分别与脑脉通和移植组比较，作用更为显著，脑脉通和联合7d组分别较移植组LN表达增高；同组内，模型组大鼠脑组织内IgG表达14d、28d较7d显著增强，IV型胶原表达14d、28d较7d显极显著降低。rn ③模型组大鼠较假手术组MMP-9表达极显著增高；治疗组较模型组MMP-9表达显著降低，TIMP-1表达显著增高；联合28d组分别较脑脉通和移植组，脑脉通和联合7d组分别较移植作用更为显著；同组内，模型组大鼠脑组织内MMP-9表达14d、28d较7d极显著增高，联合组大鼠脑组织内TIMP-1表达14d、28d较7d极显著增高。rn ④模型组大鼠较假手术组t-PA和PAI-1表达极显著增高；移植14d、28d组及脑脉通和联合各时间组较模型组t-PA表达显著降低，脑脉通、移植14d、28d组和联合各时间组PAI-1表达较模型组显著增高；联合28d组分别与脑脉通和移植组比较，PAI-1表达显著增高，联合28d组较移植组t-PA表达显著降低；同组内，模型组t-PA表达28d组分别较7d、14d组显著增强。rn ⑤脑脉通组脑组织内未见Brdu细胞及Brdu／FⅧ双标细胞；移植与联合组Brdu标记细胞进入脑组织内显著存活并显著分化为血管内皮细胞(FⅧ)；联合组各组大鼠脑组织内Brdu／FⅧ双标细胞较移植组显著增加，其中7d组FⅧ分化率、14d组Brdu标记细胞数量较移植组显著增多；同组内大鼠脑组织Brdu细胞和Brdu／FⅧ标细胞数量14d、28d组较其7d组极显著增加，28d组较其14d组显著减少。rn 结论：rn ①脑缺血再灌注后可造成大鼠脑组织的病理损伤明显，表现为神经形态学改变、脑组织含水量增加、微血管结构破坏，以14d最为严重，至28d微血管结构损伤仍维持在一个较高的水平；脑脉通、MSCs移植及其联合应用对损伤有明显的保护作用，并随着时间的延长作用更为显著，其中以联合28d组的作用较单独用药尤为全面而突出。但MSCs移植起效时间较脑脉通和联合用药晚，且对脑水肿的减轻作用没有脑脉通显著。rn ②脑缺血再灌注微血管损伤是其病理损伤的关键，表现为Ig6表达增高，IV型胶原、LN表达降低，脑脉通、MSCs移植及其联合应用能降低IgG表达，增高IV型胶原、LN表达以降低BBB的通透性，减轻微血管基底膜成分的降解，保护微血管的完整性。rn ③脑缺血再灌注后微血管损伤的机制可能与明胶酶系统和纤溶酶系统的失衡有关。脑脉通、MSCs移植及其联合应用，可通过下调MMP-9、t-PA的表达，上调TIMP-1、PAI-1的表达维持其平衡，减轻微血管基底膜成分的降解，保护微血管的完整性。rn ④脑脉通具有促进MSCs在脑组织内的存活及向血管内皮细胞分化的作用，且以14d作用最显著，故其联合用药时，作用机制相互影响，以28d组作用最为显著。