哈维氏弧菌GYC1108-1胞外蛋白酶的制备及免疫原性研究

摘要

胞外蛋白酶（ECPase）是哈维氏弧菌GYC1108-1胞外产物的主要致病因子，经鉴定其为半胱胺酸蛋白酶，分子量约55KD，能够分解脱脂奶中的酪蛋白，命名为1108-ECPase。本实验建立了胞外蛋白酶活性平板法检测1108-ECPase和YZ-ECPase的相对酶活（YZ为能够分泌目的蛋白酶的重组菌），并利用这个方法确定了细菌分泌ECPase达最高峰的培养时间为36h，粗提ECPase最适的饱和硫酸铵浓度为70%。 GYC1108-1和YZ培养上清经硫酸铵盐析，SephadexG-25凝胶过柱后，得到较为纯化的1108-ECPase和YZ-ECPase。选择白油、蜂胶和弗氏三种不同佐剂与适量抗原混匀，分别免疫3只ICR小鼠，并设不加佐剂免疫组及空白组作为对照。三次免疫后制备小鼠血清，间接ELISA测定抗体效价，除空白对照外，其它8组小鼠的免疫血清效价达1:1.6×104～1:2.56×105，免疫组的效价从高到低依次为弗氏＞白油＞蜂胶＞不加佐剂，不同佐剂的免疫效果依次为：弗氏＞白油＞蜂胶。免疫印迹实验结果表明：小鼠血清在55KD处有明显的反应条带。以上结果表明，ECP具有很好的免疫原性，这为下一步研究基因工程疫苗奠定了基础。