几丁质氧化水解酶在芽孢杆菌中的分泌表达

摘要

枯草芽孢杆菌是一种安全、高效分泌且经济的表达宿主,是饲料行业酶制剂的首选表达系统.几丁质氧化水解酶是一种对生物聚合物几丁质的降解至关重要的分子,能协同几丁质酶降解几丁质,分类到辅助酶AA10家族中.通过筛选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的信号多肽库,构建几丁质氧化水解酶CBP(Oceanobacillus)基因高效表达系统,为重组枯草芽孢杆菌的研究和应用奠定基础.通过联合无缝克隆与滚环复制,建立高通量表达载体构建平台.本研究成功建立了高通量表达载体的构建方法；构建了CBP信号多肽分泌表达载体库；通过表达分析，筛选到了2种高分泌的信号多肽，指导CBP分泌到枯草芽孢杆菌的胞外至培养基上清。通过定量分析，两种信号多肽指导CBP的分泌量每升培养物达到克级水平。通过监测CBP表达菌株的生长曲线及其胞外蛋白分析，结果显示，与原始菌株相比，转化菌株的生长和原始菌株的生长没有明显区别；CBP蛋白的表达量时间达30h。几丁质/纤维素氧化水解酶的结合活性测定，结果表明CBP对胶体几丁质的最高结合率为60%。通过对分泌途径中信号多肽的优化，建立了一种优化枯草芽孢杆菌基因表达系统的方法，为枯草芽孢杆菌表达系统的研究提供了有力平台。