原代肝细胞

摘要： 为了探讨单一天然植物水溶物和复合植物水溶物对H_(2)O_(2)损伤草鱼原代肝细胞的修复作用,以诃子(terminalia chebularetz,TCR)、天然植物复合物1(RAT)、天然植物复合物2(JLT)水溶物冻干粉为试验材料,维生素C(VC)作为对照,以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)离体培养的原代肝细胞为试验对象,利用H_(2)O_(2)建立损伤模型后分别添加含有0.1 mg/mL的TCR、RAT和JLT的细胞培养液培养24 h后检测细胞状态。结果表明:RAT、TCR和VC组与H_(2)O_(2)组相比细胞活力显著提高(P<0.05)。与H_(2)O_(2)组相比,RAT、TCR和VC组过氧化氢酶(CAT)活性均极显著上升(P<0.01),天然植物水溶物组和VC组谷胱甘肽(GSH)含量极显著升高(P<0.01),丙二醛(MDA)含量显著下降(P<0.05),超氧化物歧化酶(SOD)活性极显著下降(P<0.01),RAT组和JLT组细胞凋亡率显著降低(P<0.05),天然植物水溶物组和VC组活性氧(ROS)水平均极显著降低(P<0.01),天然植物水溶物组线粒体膜电位(MMP)均有不同程度的升高。电镜结果显示H_(2)O_(2)组细胞线粒体肿胀、嵴消失,天然植物水溶物组细胞嵴消失情况减缓,自噬小体和自噬溶酶体数量略有增加。Western Blot结果显示,与H_(2)O_(2)组相比,天然植物水溶物组Bax蛋白的表达量均有显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01),凋亡蛋白活性被抑制。转录组结果显示,天然植物水溶物能减缓细胞损伤是多个通路共同作用的结果。综上所述,天然植物水溶物对草鱼原代肝细胞的氧化应激损伤具有缓解作用,减少细胞损伤程度,对肝细胞的保护与损伤修复作用具有一定效果。

摘要： 【目的】研究c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂SP600125对仔猪原代肝细胞药物性损伤的缓解作用及机理。【方法】通过二步灌流法获得仔猪原代肝细胞,将肝细胞分为对照组(C)、JNK抑制剂组(SP)、模型组(M)和治疗组(T),每组6个重复。对照组细胞不添加药物,SP组用2μmol/L SP600125处理细胞,M组用80μg/mL脂多糖(LPS)+20μg/mL恩诺沙星(ENR)处理细胞,T组用80μg/mL LPS+20μg/mL ENR+2μmol/L SP600125处理细胞,处理12 h后,收集上清测定谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性,收集细胞测定谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及肝细胞核因子-1(hepatocyte nuclear factor 1,HNF-1)和谷胱甘肽-S-转移酶A1(glutathione S-transferase alpha 1,GSTA1)mRNA的相对表达量。【结果】与对照组相比,M组肝细胞培养液上清中ALT和AST活性均显著升高(P<0.05),M组肝细胞中GSH-Px和SOD活性、HNF-1和GSTA1 mRNA的相对表达量均极显著降低(P<0.01),MDA含量极显著提高(P<0.01);与M组相比,T组肝细胞培养液上清中ALT、AST的活性均显著下降(P<0.05),T组肝细胞中GSH-Px和SOD活性、HNF-1和GSTA1 mRNA的相对表达量均显著提高(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05)。【结论】JNK抑制剂SP600125可通过调控细胞的抗氧化能力及HNF-1和GSTA1的表达缓解由LPS/ENR导致的仔猪原代肝细胞的药物性损伤。

摘要： 目的:通过分离并提纯非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠原代肝细胞以及原代Kupffer细胞建立体外NASH原代细胞模型,为研究NASH提供可靠的细胞实验技术支持。方法:选择SD大鼠40只,随机分为2组(n=20):对照组和NASH组,对照组大鼠利用普通饲料喂养,NASH组大鼠利用高脂饲料(88%基础饲料+10%猪油+2%胆固醇)喂养,6~8周后,利用NASH评分表,病理观察下肝组织切片脂肪变+小叶内炎症+气球样变评分≥4分,表明大鼠NASH模型的成功建立,利用胶原酶原位灌注法分离并提纯NASH模型大鼠原代肝细胞以及原代Kupffer细胞,利用CK-18及CD68免疫荧光以及墨汁吞墨实验进行细胞鉴定,利用油红O染色、试剂盒测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量观察NASH大鼠原代肝细胞脂质累积和肝功情况,Western blot检测原代Kupffer细胞炎症因子表达情况,最后采用原代肝细胞:原代Kupffer细胞=6∶1比例共培养,显微镜下观察细胞状态。结果:实验成功分离并提纯NASH原代肝细胞以及原代Kupffer细胞,通过油红O染色,NASH组大鼠原代肝细胞存在明显的脂肪沉积,且NASH组大鼠原代肝细胞中AST、ALT明显高于对照组,存在明显肝损伤(P<0.05),Western blot测定原代Kupffer细胞TNF-α、IL-1β以及MCP-1,NASH组大鼠明显高于对照组(P<0.05)。结论:通过胶原酶原位灌注法可以成功分离NASH大鼠原代肝细胞以及原代Kupffer细胞,同时成功建立比例共培养大鼠体外原代细胞NASH模型。

摘要： 目的探索小鼠原代肝细胞细胞分离培养的简化方法,并对其生物学特性进行鉴定。方法分离出生2~3 d小鼠肝组织,利用低温下机械剪碎法结合胶原酶消化,分离小鼠原代肝细胞,利用小鼠肝表面抗原CK-19进行荧光染色鉴定。结果成功地从乳鼠体内分离获得肝原代细胞,免疫荧光鉴定属于肝细胞。结论利用简单的机械加酶消化法也可以获得肝组织细胞,且得率较高,细胞活力较好。

摘要： 目的探讨原代肝细胞外泌体对肝星状细胞(HSC)活化的影响。方法在原位两步胶原酶灌流法的基础上,分别分离培养小鼠原代肝细胞及HSC,采用肝细胞糖原染色法和细胞角蛋白18(CK-18)细胞化学染色法鉴定原代肝细胞,采用α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)细胞免疫荧光染色法鉴定原代HSC;采用exoEasy Maxi Kit试剂盒提取肝细胞外泌体,用电镜法、纳米颗粒跟踪分析(NTA)及蛋白免疫印迹法(Western blot)鉴定肝细胞外泌体;将肝细胞外泌体与活化HSC共培养24 h,采用逆转录-实时定量PCR(qRT-PCR)法检测HSC中α-SMA及Ⅰ型胶原(COL 1 A 1)mRNA表达。结果原位两步胶原酶灌流法成功分离培养获得小鼠原代肝细胞及HSC,肝细胞糖原染色法及CK-18细胞化学染色法证实原代肝细胞纯度>95%,免疫荧光染色显示HSC的α-SMA阳性率>90%;exoEasy Maxi Kit试剂盒提取的肝细胞外泌体在电镜下呈圆形或椭圆形,NTA结果显示其直径约140 nm,Western blot实验可见外泌体标志物分化抗原9(CD9)和肿瘤易感基因101(TSG101)表达;与空白对照组比较,HSCs与肝细胞外泌体共培养后HSCs的α-SMA及COL 1 A 1 mRNA表达水平降低(P<0.05)。结论成功提取原代肝细胞外泌体,该外泌体可抑制HSC活化。

摘要： 本试验旨在探讨过氧化氢(H2O2)诱导草鱼原代肝细胞体外氧化损伤模型的建立条件,并利用所构建的模型评价8种天然植物的抗氧化能力.采用噻唑蓝(MTT)染色法检测不同浓度[0(对照组)、100、200、400、600 μmol/L]H2O2处理草鱼原代肝细胞0.5、1.0、2.0和4.0 h后的细胞存活率,并采用微板法检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性.选择不同浓度(100、200、400、600μmol/L)H2O2处理肝细胞1.0 h后,分光光度法检测细胞中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,显微镜观察细胞形态学,流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞中活性氧(ROS)水平.通过测定清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基能力和H2O2损伤细胞存活率,评价诃子、虎杖、荷叶、车前草、侧柏叶、甘草、大黄、肉桂这8种天然植物的抗氧化能力.结果显示:与对照组相比,200 μmol/L H2O2处理肝细胞1.0 h后,细胞存活率降低到(64.85±0.38)％;LDH和MDA含量显著或极显著升高(P＜0.05或P＜0.01),SOD活性显著降低(P＜0.01);ROS水平和细胞凋亡率极显著升高(P＜0.01).诃子组的细胞存活率最高,比模型组高出80.17％～150.68％.清除DPPH自由基能力大小排序为诃子≥虎杖≥荷叶≥大黄≥肉桂＞侧柏叶＞车前草＞甘草,且氧化损伤修复能力强弱与清除DPPH自由基能力的高低排序基本一致.综上可知,200 μmol/L H2O2处理1.0 h是建立草鱼原代肝细胞氧化损伤模型的最佳试验条件.8种天然植物中诃子的抗氧化能力最佳且氧化损伤修复能力最强.

摘要： 目的 为非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)发病机制和防治研究提供可靠的原代肝细胞脂肪变性细胞模型.方法 采用Seglen两步灌流法及其改良方法分离获取小鼠原代肝细胞,体外培养48 h后,给予不同浓度的游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)混合物(油酸:棕榈酸=2:1)诱导24 h,采用油红O染色,观察肝细胞内脂滴沉积情况,全自动生化分析仪测定细胞内三酰甘油(TG)含量.结果 与对照组相比,模型组肝细胞内出现红色脂滴沉积,且与加入的FFA混合物浓度呈剂量依赖性;模型组肝细胞内TG含量明显高于对照组(P<0.05),且随着加入的FFA浓度升高而增加,提示肝细胞内脂质沉积随着加入的FFA浓度升高而增加.结论 成功构建了原代肝细胞脂肪变性细胞模型,为NAFLD的研究提供了可靠的细胞模型.

摘要： 探索肝细胞来源的Lrg1对M1型肝巨噬细胞极化的影响。选取6周的BALB/c雌性小鼠随机分为正常饮食组和高脂饮食(High-fatdiet,HFD)组,每组5只,喂养16周后HE染色观察肝组织结构,经realtime-PCR以及Western blotting检测相关基因的表达。将原代肝细胞用油酸处理24h,收上清作为条件培养基,原代肝巨噬细胞经条件培养基刺激培养12h后分别经TGF-β1(10ng/mL)单独刺激24h,以及TGF-β1(10ng/mL)和Lrg1(1μg/mL)联合刺激24h,Western botting及realtime-PCR检测相关基因的表达。

摘要： 目的:探讨AMP活化蛋白激酶(AMPK)α2在棕榈酸(PA)诱发的肝细胞脂质沉积和脂多糖(LPS)诱导的炎症中的作用和机制.方法:分离小鼠原代肝细胞,将一部分细胞分为非特异性小干扰RNA(siRNA)对照组(siNR)和敲除AMPKα2(siAMPKα2)组,每组细胞再分别用10％牛血清白蛋白(BSA)、200 μmol/L PA、磷酸盐缓冲液(PBS)、10 μg/mL LPS孵育16 h或6 h.油红O染色检测细胞中的脂质,Western印迹检测核因子κB抑制蛋白(IκB)激酶(IKK)和激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化.将另一部分肝细胞分为转染对照腺病毒组(Ad-GPF)和AMPKα2腺病毒组(Ad-AMPKα2),每组再分别用10％BSA、200 μmol/LPA、PBS、10 μg/mL LPS孵育16 h或6 h,Western印迹检测JNK和IKKα/β的磷酸化.结果:与对照组相比,siAMPKα2组PA诱导的细胞内脂质积累增加(t=2.133,P＜0.05),PA和LPS磷酸化JNK(1.51±0.08,t=2.701,P＜0.05)和 IKKα/β(1.35±0.03,t=1.657,P＜0.05)的作用加强,而AMPKα2腺病毒组PA和LPS升高JNK和IKKα/β磷酸化的作用显著受抑制.结论:AMPKα2可能通过抑制JNK及核因子-κB信号通路,改善PA诱导的肝细胞脂质沉积以及和PA和LPS诱导的肝细胞炎症.

摘要： 目的 蓝藻水华引起的微囊藻毒素污染是世界性关注话题之一,微囊藻毒素LR(MC-LR)具有强特异性肝毒性,但其引起肝损伤的确切机制尚未完全阐明.为解决这一问题,本研究从细胞分子层面探讨MC-LR造成肝细胞线粒体功能改变的分子机制.方法 提取小鼠原代肝细胞,加入梯度剂量的MC-LR(2.5～10 nmol/L)作用48 h,以未加毒素处理组为对照,检测MC-LR对线粒体功能的影响(包括ATP水平和线粒体膜电位检测),DNA损伤(包括彗星试验和8-OHdG水平检测),并分析p53抑制剂pft-α作用下线粒体功能损伤情况.结果 MC-LR造成肝细胞线粒体功能障碍,DNA损伤且p53蛋白表达水平上调;p53特异性抑制剂pft-α减轻MC-LR造成的线粒体损伤.结论 在本试验条件下,MC-LR造成小鼠肝细胞线粒体功能异常的机制与其造成DNA损伤诱导p53上调有关.

摘要： 肝脏是一个复杂且重要的器官,它在代谢及解毒过程中发挥重要作用.由于在体研究肝脏代谢、病毒作用以及药物作用的机制比较困难,因此有必要建立原代肝细胞的模型.鸭原代肝细胞模型可以作为研究嗜肝DNA病毒如鸭乙型肝炎病毒(DHBV)以及其他禽类病毒性疾病、细菌性疾病的材料,对禽类的研究提供便利.足静脉麻醉7日龄雏鸭，首先从肠静脉灌流抗凝液，剪开右心房，释放灌流液，待肝脏呈土黄色，换含有胶原酶Ⅳ的后灌流液，待肝脏变软，取出肝脏。肝脏剪碎过滤，50×g离心，收集细胞，在DMEM/F12培养基中培养。原代细胞经胰酶消化传代，获得较纯肝细胞，细胞染色、计数确定细胞得率及活性。上述两步灌流法结合胰酶消化传代可获得稳定传3代、纯度较高的肝细胞，方法简便，成功率较高，为研究肝脏代谢、病毒作用以及药物作用建立了稳定的肝细胞模型。

摘要： 目的：研究EGCG及其联合硼替佐米对HBV转基因小鼠原代肝细胞的抗HBV作用及机制.方法：采用改良的两步灌流法分离HBV转基因小鼠原代肝细胞;MTT法分别检测不同浓度的EGCG以及不同浓度的EGCG联合1μmol·L-1硼替佐米对HBV转基因小鼠原代肝细胞的细胞毒性;药物作用24h后,分别应用ELISA法和荧光定量PCR法测定细胞培养上清中HBsAg和HBV-DNA含量;采用Western blot法检测不同浓度EGCG和不同作用时间下细胞Hsp90的表达情况.结果：250μmo1·L-1及以下浓度的EGCG对细胞均无毒性作用,250μmol·L-1及以下浓度EGCG联合1μmol·L-1硼替佐米对细胞无明显毒性作用; 50μmol·L-1～250μmol·L-1EGCG单独作用时,对HBsAg和HBV-DNA具有显著性的抑制作用(P＜0.05);当250μmol·L-1的EGCG联合1μmol·L-1硼替佐米时,对HBsAg和HBV-DNA抑制作用明显强于EGCG或者硼替佐米单药作用(P＜0.05);EGCG可以抑制细胞Hsp90的表达,并且抑制作用随药物浓度的增加和作用时间的延长而增强.结论：EGCG可以抑制转基因小鼠原代肝细胞HBV的复制,与1μmol·L-1硼替佐米联用时对HBV具有协同抑制作用.

摘要： 目的:研究雷公藤红素对HBV转基因小鼠原代肝细胞的抗HBV效果.方法:改良的两步灌流法分离HBV转基因小鼠原代肝细胞;MTT法检测细胞毒性作用;药物作用24h后取上清,分别应用ELISA法和荧光定量PCR法测定HBsAg和HBV-DNA.结果:雷公藤红素对原代肝细胞TC50为6.49±0.8μmol·L-1;当浓度低于0.8μmol·L-1时对原代肝细胞没有明显毒性;在0.08μmol·L-1～0.8μmol·L-1浓度范围内对HBsAg和HBV-DNA有显著抑制作用(P＜0.05);随着雷公藤红素浓度的增加,对HBsAg和HBV-DNA的抑制作用增强.结论:雷公藤红素在原代肝细胞水平不仅能够抑制HBV-DNA的复制,而且可以有效的抑制HBsAg的表达.

摘要： 目的:观察炎症因子TNF-α对C57BL/6小鼠原代肝细胞内脂质积聚和FAT/CD36表达的影响.方法:采用IV型胶原酶原位二步灌流法制备小鼠原代肝细胞，通过收集并检测细胞培养基中白蛋白含量和免疫细胞化学的方法鉴定肝细胞。结果:所培养的原代肝细胞纯度在90%以上，且在第5天分泌的白蛋白最多，可达0.27g/L。与对照组相比，炎症因子TNF-a能显著升高细胞内甘油三酯含量(51.12士6.60μg/mg vs31.08±7.52μg/mg,P<0.05);在软脂酸背景下，TNF-a同样能升高细胞内甘油三酯含量(88.92士11.57μg/mg vs46.94±4.13μg/mg,P<0.05)。油红O染色结果也显示:一与对照组相比，软脂酸、炎症和联合干预组脂质沉积明显增多，且联合干预组最为明显。免疫组化和WesternBlot结果显示:与对照组相比，软脂酸、炎症和联合干预组FAT/CD36蛋白表达增加，且联合干预组增加更为明显。结论:成功建立小鼠原代肝细胞分离与培养方法，炎症反应可能通过上调FAT/CD36蛋白表达促使原代肝细胞脂质聚集。

摘要： 本试验目的是建立简单、高纯、易操作的鹅原代肝细胞分离培养方法,为体外研究鹅肝细胞的各类功能奠定基础.采用简化的半原位灌流结合胶原酶消化分离鹅肝细胞,观测细胞产量、存活率及细胞形态.平均每只鹅分离到2.22×107个肝细胞,每克鹅肝分离到1.32×106个肝细胞.台盼蓝染色显示成活率为90％.MTT法测细胞相对活性,绘制细胞生长曲线,符合原代细胞生长的一般规律.本实验方法简单、易操作,且不需要特殊设备,能够获得大量高活性、高纯度的鹅肝脏细胞,适合一般实验室快速分离获取鹅原代肝细胞以做进一步研究的需要.

摘要： [目的]固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)是脂肪合成基因的重要转录调节因子，又称脂肪细胞决定和分化因子1c。SREBP-1c主要在动物肝脏和脂肪细胞中表达，是脂肪代谢中重要的核转录因子，它可以通过调节脂肪代谢相关酶基因的表达来调控动物体内的脂肪合成。[方法]本试验设计合成了SREBP-1c的siRNA，通过脂质体转染将siRNA转染进犊牛原代肝细胞，用实时荧光相对定量PCR检测siRNA对SREBP-1c基因表达量的影响。[结果]siRNA通过脂质体成功转入犊牛原代肝细胞，与对照组相比，一组转染细胞在mRNA水平检测到较低的SREBP-1c基因表达量。[结论]siRNA可以稳定地在犊牛原代肝细胞中表达，并且对靶基因呈现出抑制作用。该研究为在基因水平防治奶牛肝脂沉积提供了基础。

摘要： 为了探讨铜对肉鸡原代肝细胞活性及糖原含量的影响，本实验分别用0、10、50和100μM Cu2+在体外孵育原代肝细胞，测定30min、1h、2h、4h、24h、48h和72h各时间点的原代肝细胞活性及24h时间点的糖原含量PAs染色；实验结果显示：50μM和100μM Cu2+仅分别在72h和4h时间点之后明显降低细胞活性：随着铜浓度的升高，糖原含量减少。结果表明高浓度铜可降低原代肝细胞活性，促进肝糖原分解。

摘要： 目的：研究含肝复康滴丸大鼠血清对CCl4损伤原代肝细胞的保护作用。方法：采用酶消化法分离大鼠肝实质细胞进行体外培养并建立CCl4 肝损伤模型，以AST和ALT为指标，并 采用MTT法对细胞活性和增殖进行检测，观察肝复康滴丸含药血清对肝损伤原代细胞的保护作用。结果：肝复康滴丸含药血清可使肝损伤大鼠原代细胞的增生率明显提高，AST和ALT的含量明显降低。结论：肝复康滴丸具有很好的肝细胞保护作用。

摘要： 研究对乙酰氨基酚对体外培养的大鼠原代肝细胞的影响,探讨对乙酰氨基酚导致肝损伤的机制,为临床上合理地利用保肝药物提供理论依据和数据.选用成年SD大鼠,胶原酶两步灌流法获取大鼠原代肝细胞,待肝细胞稳定后,用不同剂量的对乙酰氨基酚处理肝细胞,MTT法测定肝细胞的存活率,分光光度法测定培养上清液中一氧化氮(NO)和肝细胞内的丙二醛(MDA)的含量.结果表明:对乙酰氨基酚可导致肝细胞存活率降低,在2-20 mM对乙酰氨基酚浓度范围内,肝细胞存活率随对乙酰氨基酚浓度的增高而呈下降趋势;说明在过量时,对乙酰氨基酚对肝细胞有损伤作用,并随浓度升高而损伤作用加重.对乙酰氨基酚可导致NO含量升高.对乙酰氨基酚处理3h,20mM组NO含量与对照组之间差异显著(P＜0.05);处理6h,9h,12h,20mM组NO含量与对照组和2mM组之间差异显著(P＜0.05);处理24h,20mM组NO含量与对照组和2mM组之间差异极显著(P＜0.01).16mM组NO含量与对照组之间差异极显著(P＜0.01),与2mM组之间差异显著(P＜0.05).10mM组NO含量与对照组之间差异显著(P＜0.05).其余组之间差异不显著(P＞0.05).不同浓度的对乙酰氨基酚处理后,各处理组MDA含量变化不明显.对乙酰氨基酚导致肝细胞损伤,存活率下降;NO含量升高,轻微升高可以缓解氧化损伤,大量增加又导致肝损伤;MDA变化不明显,所以脂质过氧化反应不是引起肝损伤的主要原因.

摘要： 本文选择小鼠原代肝细胞以及肾小管上皮细胞作为模型研究了CdTe量子点的细胞毒性。首先用CCK-8法分析了CdTe量子点的细胞毒性，从整体上评价了CdTe量子点对小鼠肾小管上皮细胞及肝细胞活力的影响。在此基础上用流式细胞术探讨了经量子点暴露后细胞内量子点、锡离子的含量与量子点细胞毒性的关系、细胞对CdTe量子点所引发的氧化应激反应(ROS，MDA含量和SOD、过氧化氢酶活性指标)以及氧化应激导致的细胞凋亡。最后通过单细胞凝胶电泳技术研究了CdTe量子点产生的基因毒性。

摘要： 本公开提供涉及表现出原代人肝细胞表型的人肝细胞细胞系的体外培养物的方法和组合物。这类细胞系易于被嗜肝病毒诸如HCV或HBV感染，并且支持病毒复制和高水平的病毒颗粒产生。这类体外培养物可用于嗜肝病毒的产生和研究，以及筛选(例如，抗病毒药物、评估药物代谢)方法、和原代人肝细胞的研究。

摘要： 本发明公开了一种原代肝细胞冻存液、肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法，属于原代肝细胞冻存与复苏领域。所述原代肝细胞冻存液，由如下体积百分数的组分组成：45％溶液A、10％‑45％胎牛血清、10％二甲基亚砜和0％‑35％水，所述溶液A由如下组分组成：D‑葡萄糖、羟乙基淀粉、乳糖酸、聚乙烯吡咯烷酮、五水D‑棉子糖、氢氧化钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、腺苷、还原性谷胱甘肽、别嘌醇、牛磺熊去氧胆酸和甘草酸二氨。本发明还公开了一种肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法。本发明的原代肝细胞冻存液可以降低原代肝细胞在冻存过程中的损伤、提高解冻后原代肝细胞活力与贴壁效率，可广泛用于肝脏基础研究与新药研发过程中。

摘要： 本发明属于生命科学和医学中乙型肝炎病毒感染细胞模型领域，提供了一种用于乙肝病毒感染的原代肝细胞来源的肝前体样细胞模型、制备方法及应用，该肝前体样细胞模型由三维分化后的功能肝细胞组成，该三维分化后的功能肝细胞由人原代肝细胞在体外转化培养后得到的肝前体样细胞经三维培养和肝向成熟培养后得到。通过实验验证，本发明中的肝前体样细胞模型感染HBV后，能够高表达RXRA、HNF4A、NTCP等HBV感染相关基因，可用于乙肝病毒感染研究或和HBV共培养用于制备乙肝病毒感染细胞模型。

摘要： 本发明公开了一种利用猪原代肝细胞和hNTCP重组慢病毒建立乙肝病毒感染细胞模型的方法，属于细胞改造技术领域。其包括如下步骤：步骤1：制备hNTCP重组慢病毒浓缩液；步骤2：制备消化完全的肝组织；步骤3：制备猪原代肝细胞；步骤4：制备猪原代肝细胞单细胞悬液；步骤5：制备铺板用细胞悬液；步骤6：细胞铺板与培养；步骤7：对猪原代肝细胞进行hNTCP重组慢病毒感染；步骤8：建立乙肝病毒感染细胞模型。本发明在体外构建含hNTCP基因的重组慢病毒，通过高感染效率的慢病毒将hNTCP基因整合到猪原代肝细胞基因组中，实现hNTCP稳定过表达，使猪原代肝细胞支持乙肝感染。

摘要： 本发明公开了一种人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法，该方法是将新鲜的肝组织经暴露的血管用灌注溶液I和灌注溶液II冲洗干净；直至肝组织失去弹性消化完全；然后置于含有细胞洗液的培养皿中，筛选得到单细胞悬液；低密度接种到胶原包被的培养板或培养皿中培养，首先在生长因子的作用下形成100%融合度的单层共培养；最后置于加入含有2%DMSO的维持培养液培养；肝细胞堆积形成肝非实质细胞环绕、入侵生长的肝岛状结构。本发明利用常规的肝细胞分离技术，实现了长达120天的肝细胞体外长期培养与长达72天保持HBV易感性。并且该系统可发展为新的抗HBV药物筛选与评价平台，对抗病毒药物研究具有重要价值。

摘要： 本发明提供了一种小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用，涉及原代细胞分离技术领域。小鼠原代肝细胞的分离方法，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；第三灌流，用第三灌流液进一步消化。该小鼠原代肝细胞的分离方法缓解了现有技术中缺乏一种分离后细胞活性高、贴壁迅速、存活细胞收率高、分离成本低并且分离过程不易污染的小鼠原代肝细胞分离方法的技术问题。

摘要： 本发明公开了一种原代肝细胞冻存液、肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法，属于原代肝细胞冻存与复苏领域。所述原代肝细胞冻存液，由如下体积百分数的组分组成：45％溶液A、10％‑45％胎牛血清、10％二甲基亚砜和0％‑35％水，所述溶液A由如下组分组成：D‑葡萄糖、羟乙基淀粉、乳糖酸、聚乙烯吡咯烷酮、五水D‑棉子糖、氢氧化钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、腺苷、还原性谷胱甘肽、别嘌醇、牛磺熊去氧胆酸和甘草酸二氨。本发明还公开了一种肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法。本发明的原代肝细胞冻存液可以降低原代肝细胞在冻存过程中的损伤、提高解冻后原代肝细胞活力与贴壁效率，可广泛用于肝脏基础研究与新药研发过程中。

摘要： 本发明属于生命科学和医学中乙型肝炎病毒感染细胞模型领域，提供了一种用于乙肝病毒感染的原代肝细胞来源的肝前体样细胞模型、制备方法及应用，该肝前体样细胞模型由三维分化后的功能肝细胞组成，该三维分化后的功能肝细胞由人原代肝细胞在体外转化培养后得到的肝前体样细胞经三维培养和肝向成熟培养后得到。通过实验验证，本发明中的肝前体样细胞模型感染HBV后，能够高表达RXRA、HNF4A、NTCP等HBV感染相关基因，可用于乙肝病毒感染研究或和HBV共培养用于制备乙肝病毒感染细胞模型。

摘要： 本发明公开了一种利用猪原代肝细胞和hNTCP重组慢病毒建立乙肝病毒感染细胞模型的方法，属于细胞改造技术领域。其包括如下步骤：步骤1：制备hNTCP重组慢病毒浓缩液；步骤2：制备消化完全的肝组织；步骤3：制备猪原代肝细胞；步骤4：制备猪原代肝细胞单细胞悬液；步骤5：制备铺板用细胞悬液；步骤6：细胞铺板与培养；步骤7：对猪原代肝细胞进行hNTCP重组慢病毒感染；步骤8：建立乙肝病毒感染细胞模型。本发明在体外构建含hNTCP基因的重组慢病毒，通过高感染效率的慢病毒将hNTCP基因整合到猪原代肝细胞基因组中，实现hNTCP稳定过表达，使猪原代肝细胞支持乙肝感染。

摘要： 本发明属生物技术领域,涉及生物材料保存技术,具体涉及一种体外哺乳动物肝细胞系统的复苏方法。本发明方法中将冷冻的原代肝细胞从液氮中取出水浴解冻后，将原冻存细胞液直接加入到含1 ml的incubation buffer，蓝染色后细胞计数并计算细胞活率；本方法省略了复苏原代肝细胞中的离心步骤，简化缩短了复苏原代肝细胞的方法时间；结果证明，通过避开离心步骤，能提高原代肝细胞的实际回收率和活性，便于后面试验的利用，以及未离心导致的DMSO的残留对原代肝细胞的代谢能力和活性无影响，本方法可以广泛被使用到药物在肝细胞中的代谢稳定性、肝细胞对药物的摄取评价等试验中。