重组载体

摘要： 为构建新型表面活性肽的表达载体,并探讨其在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化,将编码新型活性肽A_(6)K的重复DNA片段(A_(6)K)_(15)分别插入到4中不同的原核表达载体中,经酶切和测序验证后,转化到3种不同的表达宿主进行表达,通过改变异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)浓度、诱导温度和时间来优化表达条件。表达产物通过镍-次氮基三乙酸(nickel-nitrilotriacetic acid,Ni-NTA)螯合层析进行纯化,通过(A_(6)K)_(15)上的6×His与抗体特异性结合进行Western blot分析,用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法测定产物浓度,进行经济效益分析。构建了含有目的基因(A_(6)K)_(15)的重组表达质粒,筛选出最优载体pET-28a-SUMO-(A_(6)K)_(15)和最优宿主BL21(DE3)。当IPTG终浓度为1.0 mmol/mL,诱导温度为30°C,时间为12 h时,表面活性肽(A_(6)K)_(15)的表达量最高,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot鉴定含有此新型小分子多肽(A_(6)K)_(15)。该研究成功构建了新型表面活性肽(A_(6)K)_(15)表达载体,并得到其最优表达条件,使其大量表达及纯化,为生物方法制备新型表面活性肽提供了思路。

摘要： 目的:构建表达重组环氧合酶1 (COX1)真核表达载体,验证其体外能够催化底物合成前列腺素E1 (PGE1),以寻找高效获得PGE1的方法.方法:提取人微血管内皮细胞(HMECs)总RNA,逆转录成cDNA,以cDNA为模板,PCR扩增人COX1基因,经双酶切后与真核表达载体pCMV6连接,构建重组pCMV6-COX1真核表达质粒.通过生物信息学在线工具分析COX1蛋白的疏水性、跨膜区域、信号肽、二级结构和三级结构.采用脂质体将重组质粒转染至HEK-293F细胞中,将细胞随机分为对照组(未转染重组质粒的HEK-293F细胞)、转染重组质粒2d组和转染重组质粒5d组,分别收集细胞和细胞培养上清,Western blotting法检测COX1蛋白表达水平.比较真核表达的COX1蛋白与羊精囊提取法制备的粗酶混合物催化底物二高-γ-亚麻酸合成PGE1的酶活性.结果:经PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建pCMV6-COX1重组载体,目的基因长度约为1 800 bp.生物信息学分析,COX1蛋白为水溶性蛋白,1～53位氨基酸为信号肽,34～53位氨基酸处于跨膜区域,有36个丝氨酸磷酸化位点、14个苏氨酸磷酸化位点和9个酪氨酸磷酸化位点.二级结构预测,不规则卷曲所占比例为46.20％,其次为α螺旋占41.03％.延伸链和β-转角分别占10.18％和2.58％.Western blotting法检测,重组质粒成功转染至HEK-293F细胞中,与转染重组质粒2d组比较,转染重组质粒5d组细胞培养上清中COX1蛋白表达水平明显升高(P＜0.05),蛋白相对分子质量为70 000.当底物浓度为1％时,COX1蛋白催化底物合成PGE1的含量为(50.01±1.37) ng·L-1,其活性相当于5个羊精囊制备的粗酶活性的(90.30±0.06)％.结论:通过基因工程技术构建和表达的COX1蛋白能够催化底物合成PGE1并满足临床要求.

摘要： 目的 研究构建人单纯疱疹病毒(HSV)血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)转基因重组体(HSV-PDGF-BB),转染大鼠脑星型胶质细胞后其表达水平及生物活性.方法 采用聚合酶链式反应合成大鼠PDGF-BB基因,克隆并构建HSV-PDGF-BB重组体,构建成功后转染大鼠脑星型胶质细胞,并进行筛选鉴定.用免疫组化、蛋白印迹反应检测星型胶质细胞中PDGF-BB的定位及表达水平,并观察转染后星型胶质细胞的增殖能力.结果 成功构建了HSV-PDGF-BB重组体,转染后星形胶质细胞的PDGF-BB表达水平明显上调(P<0.05),且明显促进星形胶质细胞的增殖(P<0.05).结论 构建的HSV-PDGF-BB重组体能有效转染大鼠脑星型胶质细胞,并促进PDGF-BB的表达,增强转染后细胞的增殖能力.

摘要： 为实现鲎素Ⅰ基因的高效表达,以对鲎素Ⅰ敏感度较低的里氏木霉为宿主,构建鲎素Ⅰ里氏木霉表达系统.根据里氏木霉偏爱密码子优化合成鲎素Ⅰ基因,构建鲎素Ⅰ-里氏木霉组成型表达载体pAN-PSGT-Tac,经PEG介导转化至里氏木霉原生质体,PCR法鉴定重组子基因型.基因型鉴定和基因测序检测显示,鲎素Ⅰ基因成功重组到里氏木霉基因组DNA上,因此本研究成功构建了鲎素Ⅰ里氏木霉表达系统.

摘要： 目的 分别构建绿色荧光蛋白(GFP)与氨基端或羧基端缺失突变乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)的重组表达载体,建立稳定表达GFP/HBxn、GFP/HBxc融合蛋白的HepG2细胞系,以进一步研究HBx缺失突变对其生物功能的影响.方法 PCR法分别扩增氨基端缺失50aa的HBx及羧基端缺失50aa的HBx基因,用HindⅢ和KpnⅠ双酶切定向插入pEGFP-C1相应酶切位点并转化宿主菌DH5α,双酶切鉴定pGFP/HBxn、pGFP/HBxc;脂质体转染法转染HepG2细胞,G418筛选出抗性细胞克隆,荧光显微镜下观察GFP的表达,挑选抗性克隆细胞扩大培养并传代.RT-PCR法、Western blot法检测转染细胞HBxn、HBxc基因、蛋白的表达.结果 扩增的HBxn、Hbxc基因片段琼脂糖凝胶电泳显示符合预估大小.重组质粒pGFP/HBxn、pGFP/HBxc经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后电泳,符合预估大小;转染pGFP/HBxn及pGFP/H Bxc的HepG2细胞可见抗性细胞克隆形成,并可见阳性克隆细胞均有GFP表达.RT-PCR与Western blot法检测到HBxn、HBxc的表达.结论 成功构建了GFP/HBxn、GFP/H Bxc真核重组表达载体pGFP/HBXn、pGFP/HBxc,获得了稳定表达GFP/HBxn、GFP/H Bxc融合蛋白的HepG2细胞系,为进一步研究HBx缺失突变对其生物功能的影响奠定了基础.%Objective To construct the recombinant plasmids containing GFP-tagged hepatitis B virus X protein (HBx) with deletion mutation at N-terminus (GFP/HBxn) or C-terminus (GFP/HBxc),and to establish the stably transfected HepG2 cell lines respectively expressing GFP/HBxn and GFP/HBxc fusion protein for exploring the impact of HBx deletion mutation on biological function.Methods HBx gene with 50aa deletion at N-terminus or C-terminus was amplified by PCR and digested by HindⅢ and Kpn Ⅰ.The purified gene fragments were inserted into pEGFP-C1.The recombinant plasmids containing pGFP/HBxn or pGFP/HBxc were introduced into DH5α and identified by restriction endonuclease analysis.HepG2 cells were transfected with pGFP-HBxn and pGFP-HBxc using lipofectamine reagent,respectively.The resistant cell clones were selected with G418 and the expression of GFP was examined under a fluorescence microscope.The cells expressing GFP/HBxn or GFP/HBxc were isolated,cultured and passaged,and the expression of HBxn and HBxc was detected by RT-PCR and Western blot.Results The amplified HBxn and Hbxc gene fragments were identical with expectation by agarose gel electrophoresis.G418-resistant cell clones expressing GFP were observed in HepG2 cells transfected with pGFP-HBxn or pGFP-HBxc.RT-PCR and Western blot showed that HBxn and HBxc were expressed in the transfected cells.Conclusion The GFP/HBxn and GFP/HBxc recombinant expression vectors were successfully constructed,and the stably transfected HepG2 cell lines expressing GFP/HBxn or GFP/HBxc fusion protein were established.It will be helpful to further study the impact of HBx deletion mutation on biological function.

摘要： 目的：制备生长激素释放激素受体剪接变异体1（GHRHR-SV1）抗体，并检测 GHRHR-SV1蛋白在黑色素瘤细胞中的表达情况，为后续的肿瘤机制研究奠定基础。方法：设计 GHRHR-SV1基因序列，将其插入质粒 pET-32a （＋）中，构建 pET-GHRHR-SV1重组载体，经 PCR 及测序鉴定后，转入大肠杆菌 BL21（DE3）中，分别加入0、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol·L－1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）；诱导1、2、4和6 h，并在37°C、30°C和25°C不同温度下进行诱导；观察目的蛋白表达的最佳 IPTG浓度、时间和温度。亲和层析纯化重组蛋白，将纯化后的蛋白免疫家兔，制备兔多克隆抗体， ELISA法检测该抗体效价， Western blotting法检测 GHRHR-SV1蛋白在黑色素瘤细胞系 B16-F10中的表达情况。结果：重组载体 pET-GHRHR-SV1构建成功。在 IPTG浓度为2.0 mmol· L－1时目的蛋白的表达量最高；IPTG诱导蛋白表达2 h时，蛋白表达量最大；当温度为25°C时，蛋白的表达量最大。诱导表达的蛋白相对分子质量约为24000，纯化后纯度为80％， GHRHR-SV1抗体效价为1∶1600000，B16-F10细胞中有 GHRHR-SV1蛋白表达。结论：成功制备 pET-GHRHR-SV1重组载体。GHRHR-SV1蛋白在 IPTG浓度为2.0 mmol·L－1、诱导时间为2 h和温度为25°C的条件下表达最佳。成功制备了高效价的 GHRHR-SV1抗体。黑色素瘤细胞系中有 GHRHR-SV1蛋白表达。%Objective:To prepare the polyclonal antibody against growth hormone-releasing hormone receptor splice variant 1 (GHRHR-SV1),and to detect the expressions of GHRHR-SV1 protein in melanoma cells,and to lay a foundation for further study of the pathogenesis of tumor. Methods:The gene sequence of GHRHR-SV1 was designed and synthesized,and then cloned into pET-32 a (+)plasmid to construct the recombinant vector pET-GHRHR-SV1. After identification by PCR and sequencing, the recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3).Then 0,0.5,1.0,1.5,and 2.0 mmol·L-1 isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)were added respectively to induce for 1,2,4,and 6 h at 37°C,30°C,and 25°C.The optimal dosage,time and temperature of IPTG of the target protein were observed.The protein was expressed under the optimal condition and purified by affinity chromatography.The polyclonal antibody was obtained by immunizing the rabbit with the purified protein.The titer was assayed by ELISA method.The expression of GHRHR-SV1 protein in B16-F10 cells was detected by Western blotting method. Results:The recombinant vector pET-GHRHR-SV1 was constructed successfully.The expression amount of GHRHR-SV1 protein was the highest when it was induced by 2.0 mmol · L-1 IPTG for 2 h at 25°C. The relative molecular weight of induced protein was 24 000. After purification,the purity of protein was 80%.The GHRHR-SV1 antibody titer was 1∶1 600 000.The GHRHR-SV1 protein was expressed in B16-F10 cells.Conclusion:The recombinant vector pET-GHRHR-SV1 is constructed successfully.The expression amount of GHRHR-SV1 protein in the condition of 2.0 mmol · L-1 IPTG,2 h-induction and at 25°C is the highest.The high titer of ployclonal antibody is obtained.The GHRHR-SV1 protein can express in melanoma cells.

摘要： 目的：构建含乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）增强子Ⅱ（enhancerⅡ，EnhⅡ）、核心启动子区（basal core promoter，BCP）和 C 区基因的真核表达载体，以研究 EnhⅡ、BCP 和 C 区基因的生物功能。方法提取 HBV DNA，PCR 法扩增 EnhⅡ-BCP-C 区基因片段；HindⅢ和 XbaⅠ双酶切 PCR 产物，胶回收纯化的 DNA 片段，连接入载体 pBudCE4．1，酶切及 DNA 测序鉴定重组载体。采用脂质体介导的方法将重组载体 DNA 转染 HepG2细胞和HeLa 细胞，酶联免疫吸附试验检测重组载体转染的 HepG2细胞、HeLa 细胞上清液及细胞裂解物中乙型肝炎 e 抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）的表达水平。结果双酶切及 DNA 测序鉴定，含840 bp HBV EnhⅡ-BCP-C 区基因片段的重组载体构建成功。EnhⅡ＋BCP＋C／pBudCE4．1重组载体转染 HepG2细胞24、48 h 后的上清液和转染48 h 后裂解物中 HBeAg 表达水平均明显高于 pBudCE4．1空载体转染 HepG2细胞（均 P＜0．05），EnhⅡ＋BCP＋C／pBudCE4．1重组载体转染 HeLa 细胞24、48 h 后的上清液和转染48 h 后的裂解物中 HBeAg 表达水平与pBudCE4．1空载体转染 HeLa 细胞比较差异均无统计学意义（均P＞0．05）。结论成功构建 HBV EnhⅡ-BCP 启动-C 基因肝细胞特异表达的真核载体，有利于进一步研究 EnhⅡ、BCP 和 C 区基因某些突变位点的生物学意义。%ABSTRACT:Objective To construct eukaryotic expression vector carrying HBV EnhⅡ(enhan-cer Ⅱ,EnhⅡ)-core promoter region and C region gene with an aim to study the functions of HBV EnhⅡ,basal core promoter and C gene of HBV.Methods HBV DNA was extracted from infec-ted serum and used as a template for amplification of HBV EnhⅡ-core promoter region and C re-gion gene by PCR.The PCR products was digested with HindⅢ and XbaI and purified from agar-ose gel after electrophoresis.The purified DNA fragment was linked with digested vector pBudCE4.1.Digestion with HindⅢ and XbaⅠ and DNA sequencing were used to identify the re-combinant vector which was transfected into HepG2 cells and HeLa cells.ELISA was applied to detect the expression levels of HBeAg in supernatant and lysates of plasmid-transfected HepG2 cells and HeLa cells.Results Digestion with HindⅢ and XbaⅠand DNA sequencing conformed that the eukaryotic expression vector pBudCE4.1/EnhⅡ/BCP/C was constructed successfully. The expression levels of HBeAg in supernatant (24 and 48 hours after transfection)and lysates (48 hours after transfection)of recombinant vector EnhⅡ + BCP + C/pBudCE4.1-transfected HepG2 cells were significantly higher than those of empty vector pBudCE4.1-transfected HepG2 cells (P 0.05).Conclusion The eukaryotic expression vector carrying HBV EnhⅡ-core promoter region and C region gene was constructed successfully,making it possible to study biological sig-nificance of site mutations of EnhⅡ-core promoter region and C region within HBV genome.

摘要： 目的 体外构建及鉴定shRNA-Bmi1重组载体,探讨靶向沉默原癌基因Bmi1对人胆囊癌细胞Bmi1mRNA表达、蛋白表达及对裸鼠皮下移植瘤hTERT表达的影响.方法 针对Bmi1不同位点构建4个shRNABmi1重组质粒,采用倒置荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR和Western blot检测各组Bmi1mRNA和蛋白表达,选择有效干扰组进行体内实验.构建GBC-SD裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为shRNA-Bmi-4组(实验组)、shRNA-Scramble(错配组),Lipofectamine(阴性对照组),GBC-SD(空白对照组).成瘤后进行移植瘤治疗,治疗6周后处死裸鼠,免疫组化检测裸鼠移植瘤hTERT蛋白表达水平.结果 成功构建了shRNA-Bmi1重组载体.转染胆囊癌48 h后倒置荧光显微镜观察发现shRNA-Bmi1-4组GBC-SD绿色荧光强度增强、转染效率最高,RT-PCR及Western blot结果显示shRNA-Bmi1-4组mRNA及蛋白表达量均明显低于各对照组(P＜0.05),对照组间表达量差异无统计学意义(P＞0.05).选取shRNA-Bmi1-4组作为有效干扰序列作后续体内实验.免疫组化检测shRNA-Bmi-4组裸鼠移植瘤hTERT蛋白表达水平明显低于各对照组(P＜0.05),对照组间蛋白表达量差异无统计学意义(P＞0.05).结论 体外成功构建了shRNA-Bmi1重组载体,顺利进行重组载体的转化和转染实验.靶向沉默Bmi1基因可有效促进胆囊癌细胞Bmi1mRNA降解、抑制其蛋白的表达,同时有效抑制GBC-SD裸鼠移植瘤hTERT蛋白表达.

摘要： 目的：对比同源重组与Gibson Assembly两种方法构建腺病毒载体的效率。方法：增殖并提取AD4 DNA，分别用同源重组与Gibson Assembly两种方法，将AD4 DNA镶嵌入pBR322质粒，构建出携带有全长AD4 DNA的腺病毒载体，并进行PCR和测序鉴定，对比两种方法构建腺病毒载体的筛选效率。结果：两种方法均能构建出正确的腺病毒载体；筛选同源重组法1000个菌落中，鉴定360个，仅有1个菌落；Gibson Assembly法112个菌落数中，鉴定其中10个，有3个阳性。结论：Gibson Assembly方法比传统同源重组方法在构建腺病毒载体时更有效。%[ Abstract]Objective:To compare the efficiency of traditional homologous recombination method with Gibson Assembly method in constructing adenovirus vector. Methods:AD4 DNA was proliferated and extracted,and inlaid AD4 into the pBR322 DNA plasmid and constructed adenovirus vector with total length of the AD4 DNA by homologous recombination method or Gibson Assembly method,which was amplified by PCR and sequenced for identification. Then,the efficiency of two methods was com-pared. Results:Both methods could construct the adenovirus vector of right sequence. There were o-ver 1 000 colonies in the plate using homologous recombination method,among which 360 colonies were identified and there was only one positive result. Although there were only 112 colonies in the plate using Gibson Assembly,10 colonies among then were identified and there were three positive re-sults. Conclusion:Gibson Assembly method is more efficient than traditional homologous recombina-tion method in constructing adenovirus vector.

摘要： 目的：构建含乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）增强子Ⅱ（enhancerⅡ，EnhⅡ）、核心启动子区（basal core promoter，BCP）和 C 区基因的真核表达载体，以研究 EnhⅡ、BCP 和 C 区基因的生物功能。方法提取 HBV DNA，PCR 法扩增 EnhⅡ-BCP-C 区基因片段；HindⅢ和 XbaⅠ双酶切 PCR 产物，胶回收纯化的 DNA 片段，连接入载体 pBudCE4．1，酶切及 DNA 测序鉴定重组载体。采用脂质体介导的方法将重组载体 DNA 转染 HepG2细胞和HeLa 细胞，酶联免疫吸附试验检测重组载体转染的 HepG2细胞、HeLa 细胞上清液及细胞裂解物中乙型肝炎 e 抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）的表达水平。结果双酶切及 DNA 测序鉴定，含840 bp HBV EnhⅡ-BCP-C 区基因片段的重组载体构建成功。EnhⅡ＋BCP＋C／pBudCE4．1重组载体转染 HepG2细胞24、48 h 后的上清液和转染48 h 后裂解物中 HBeAg 表达水平均明显高于 pBudCE4．1空载体转染 HepG2细胞（均 P＜0．05），EnhⅡ＋BCP＋C／pBudCE4．1重组载体转染 HeLa 细胞24、48 h 后的上清液和转染48 h 后的裂解物中 HBeAg 表达水平与pBudCE4．1空载体转染 HeLa 细胞比较差异均无统计学意义（均P＞0．05）。结论成功构建 HBV EnhⅡ-BCP 启动-C 基因肝细胞特异表达的真核载体，有利于进一步研究 EnhⅡ、BCP 和 C 区基因某些突变位点的生物学意义。

摘要： 本研究的目的是探索HBV大分子表面蛋白基因(preS1/S2/S基因)真核重组载体在细胞中的表达及对细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38等信号传导通路的影响.方法：设计合成2对寡核苷酸引物,以adr亚型HBV质粒pHBVDNA为模板,采用PCR法分别扩增HBV大分子表面蛋白基因(preS1/S2/S基因)片段;用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后,连接到质粒pcDNA3.1(+)相应酶切位点,转化宿主菌DH5α,分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒.真核重组载体脂质体法转染HepG2细胞,G418筛选抗性克隆,分别用EIA法测定目的基因的表达及细胞免疫组化法检测对细胞信号传导通路的影响.结果：成功构建了HBV大分子表面蛋白基因(preS1/S2/S基因)真核重组载体.preS1表位多肽、preS2表位多肽和HBsAg高效表达.细胞免疫组化示对细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38等信号传导通路产生不同程度的影响.结论：所构建的真核重组载体转染细胞后可介导高水平抗原表达,并获得稳定表达的细胞株,preS1/S2/S基因对细胞信号传导通路有激活作用.

摘要： 本文从HSV-1的分子生物学、HSV-1的潜伏感染、重组型HSV-1载体的构建、HSV-1重组载体在神经系统中的表达研究、HSV-1重组载体的应用五个方面论述了 HSV-1重组载体与神经系统疾病的基因治疗。

摘要： 为构建能稳定携带TAT-Apoptin的重组减毒鼠伤寒沙门菌.以pMD-19T-Apoptin为模板,PCR扩增出TAT-Apoptin基因,连接至pYA3493,构建重组载体pYA3493-TAT-Apoptin,然后将其电转至减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasdSL1344,并对该重组减毒沙门菌生长特性、遗传稳定性和表达特性进行分析.PCR和测序表明,成功构建重组载体pYA3493-TAT-Apoptin,进一步对重组减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasdSL1344(pYA3493-TAT-Apoptin)研究发现,其生长速度与强毒株SL1344相比明显减慢,与缺失株ΔcrpΔasdSL1344及互补菌株ΔcrpΔasdSL1344(pYA3493)基本一致,且能够稳定遗传TAT-Apoptin基因,重组菌培养上清经SDS-PAGE能检测到TAT-Apoptin蛋白条带.以上结果证明,能稳定携带TAT-Apoptin的重组减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasdSL1344(pYA3493-TAT-Apoptin)构建成功,且该重组菌能分泌性表达TAT-Apoptin蛋白,进一步为减毒鼠伤寒沙门菌携带Apoptin的体外协同抗肿瘤作用研究奠定一定的基础.

摘要： 应用RT-PCR方法先提取成牛肝脏外部脂肪和犊牛大网膜前脂肪细胞培养物(第13日龄)总RNA,先后扩增出ADPN cDNA的501 bp片段基因,分别克隆到载体PMD18-T中,构建重组载体PMD18-T/牛ADPN1和PMD18-T/牛ADPN2.筛选出阳性克隆,通过限制性内切酶酶切鉴定和重组质粒PCR鉴定后对其进行测序.ADPN1和ADPN2两次测序结果完全一致.从脂肪组织总RNA中扩增得到501 bp片段ADPN基因,其cDNA序列与GenBank牛ADPN基因序列同源性为85％,其氨基酸同源性为96％.成功地克隆ADPN基因501 bp片段cDNA.

摘要： 本文构建了犬2型腺病毒E3区狂犬病毒糖蛋白转换表达载体,并且讨论了重组载体在MDCK细胞系上的表达.

摘要： 目的构建趋化因子受体CCR5反义RNA真核表达载体以用于抗HIV-1的研究.方法用RT-PCR从健康人外周血单个核细胞(PBMCs)中获得趋化因子受体CCR5翻译起始区的基因片段,用基因重组技术将此目的基因以正、反两个方向定向插入到逆转录病毒载体pLXSN.用PCR、内切酶分析及序列测定鉴定.重组载体用脂质体转染剂(lipofectAMINE)转染PA317包装细胞,建立稳定表达重组假病毒颗粒的包装细胞系.结果从正常人PBMCs中获得的目的基因成功的构建了CCR反义RNA重组表达载体,重组载体已在PA317细胞中得到整合.结论构建的CCR正、反义RNA表达载体可有效地感染PA317细胞并在基因组中整合,为进一步研究CCR反义RNA的抗HIV-1的作用奠定了基础.

摘要： 本试验以大肠杆菌BJ5183为宿主菌,应用其高效同源重组机制,进行腺病毒大片段目的基因克隆的研究.旨在建立一种快速克隆大片段腺病毒基因组的方法.

摘要： 本试验以大肠杆菌BJ5183为宿主菌,应用其高效同源重组机制,进行腺病毒大片段目的基因克隆的研究.旨在建立一种快速克隆大片段腺病毒基因组的方法.

摘要： 本试验以大肠杆菌BJ5183为宿主菌,应用其高效同源重组机制,进行腺病毒大片段目的基因克隆的研究.旨在建立一种快速克隆大片段腺病毒基因组的方法.

摘要： 本发明提供一种构建重组腺病毒载体的方法，用C亚型人腺病毒基因组的E4基因序列改造AdC6的E4基因序列以提高重组腺病毒产量。以本发明的方法可构建得到非复制型腺病毒载体，可用作疫苗载体，实验证明可在其E1/E3/E4/Fiber/Hexon等区域插入外源基因，用于疫苗开发或基因治疗。以本发明的方法还可构建得到条件复制型腺病毒载体，即溶瘤病毒载体，并可在其△E3或E1或E4等区域插入了各种促进溶瘤的外源基因以增强溶瘤作用：实验证明所得重组溶瘤病毒可在多种肿瘤细胞中复制，并裂解肿瘤细胞；动物实验中重组溶瘤病毒都可有效抑制肿瘤进展，甚至清除肿瘤，表明其具有治疗肿瘤的潜力，可进一步向临床推进。

摘要： 本文描述了用于产生重组腺相关病毒(rAAV)载体的核酸、AAV转移盒和质粒。所公开的核酸、盒和质粒包含表达一种或多种转基因的序列，所述一种或多种转基因在一种或多种疾病或病症的改善、治疗和/或预防中具有治疗功效。

摘要： 提供了以高回收率或高滴度产生重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的方法。还提供了将rAAV载体浓缩至高浓度的方法，例如，高达5E+13(5×1013)个载体基因组/毫升(Vg/ml)，几乎没有任何rAAV聚集体。

摘要： 本发明提供了一种用于表达无纯化标签的人源铜锌超氧化物歧化酶的重组载体，所述重组载体由原始载体和包含人源铜锌超氧化物歧化酶基因编码序列SEQ ID NO 1的核苷酸片段组成。本发明还提供了包含该重组载体的重组菌株，以及制备所述重组载体和重组菌株的方法。本发明可用于在工业上以高产率制备具有高比活力的人源铜锌超氧化物歧化酶。

摘要： 本发明实施例涉及一种重组载体、包装有该重组载体的黑猩猩腺病毒在制备2019新型冠状病毒疫苗中的应用，所述2019新型冠状病毒疫苗为鼻腔给药剂；所述重组载体包括：骨架载体和连接在骨架载体上的包含有目的基因的核酸序列；所述骨架载体是复制缺陷型7型黑猩猩腺病毒载体。使用重组AdC7疫苗通过鼻腔进行免疫，可以很好的激活粘膜免疫系统，对于主要通过呼吸道感染的新冠病毒可以快速的反应，清除病毒，降低病毒对宿主的损伤。

摘要： 本发明提供了一种用于表达无纯化标签的人源铜锌超氧化物歧化酶的重组载体，所述重组载体由原始载体和包含人源铜锌超氧化物歧化酶基因编码序列SEQ ID NO 1的核苷酸片段组成。本发明还提供了包含该重组载体的重组菌株，以及制备所述重组载体和重组菌株的方法。本发明可用于在工业上以高产率制备具有高比活力的人源铜锌超氧化物歧化酶。

摘要： 本发明实施例涉及一种重组载体、包装有该重组载体的黑猩猩腺病毒在制备2019新型冠状病毒疫苗中的应用，所述2019新型冠状病毒疫苗为鼻腔给药剂；所述重组载体包括：骨架载体和连接在骨架载体上的包含有目的基因的核酸序列；所述骨架载体是复制缺陷型7型黑猩猩腺病毒载体。使用重组AdC7疫苗通过鼻腔进行免疫，可以很好的激活粘膜免疫系统，对于主要通过呼吸道感染的新冠病毒可以快速的反应，清除病毒，降低病毒对宿主的损伤。

摘要： 本发明涉及分子生物学和蛋白质技术领域，具体涉及重组载体的构建方法及其构建的重组载体及应用。本发明提供的构建方法操作简便，本发明提供的重组载体能够表达包括IgG抗体、Fab抗体、Fv抗体、人源化ScFv‑Fc抗体以及鼠/人嵌合抗体等各类不同功能的抗体，提高了抗体表达效率。

摘要： 本发明公开了DNA片段，由序列表中的SEQ ID NO.1所示的碱基序列组成。本发明还公开了含有外源多核苷酸的重组载体，包含原始载体以及HSP70‑MLAA34融合基因。本发明还公开了构建含有外源多核苷酸的重组载体的方法，利用序列表中的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物序列扩增得到含有SEQ ID NO.4所示的碱基序列的HSP‑70基因，利用序列表中的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物序列扩增得到含有SEQ ID NO.7所示的碱基序列的MLAA‑34基因，以HSP‑70基因和MLAA‑34基因为模板，利用序列表中的SEQ ID NO.2和序列表中的SEQ ID NO.6所示的引物序列，扩增得到序列表中的SEQ ID NO.1所示的HSP70‑MLAA34融合基因，将HSP70‑MLAA34融合基因构建到原始载体上以得到重组载体。本发明还公开了包含HSP70‑MLAA34融合基因的转染细胞。

摘要： 本发明提供一种重组载体、利用该载体制备的重组杆状病毒以及该病毒在疟疾疫苗制备中的应用。该重组载体由一段重组序列插入到pFastBacDual载体中构建而成，所述重组序列为根据CMV、Ph、SP、TM序列，在SP和TM间加入EcoR I酶切位点和Xho I酶切位点，CMV-F前加入KpnI酶切位点，TM-R后加入HindIII酶切位点形成。该重组杆状病毒由约氏疟原虫Pys25抗原基因插入到该重组载体并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，然后转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到。该重组杆状病毒通过简单地分离纯化，制备抗体具有良好的效价，能够为P25疟疾疫苗的研究提供参考。