猪圆环病毒2型(PCV2)

摘要： 【目的】了解目前广东省猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)分离株的基因型和进化特征,为广东省PCV2防控及疫苗株的筛选提供参考依据。【方法】运用PCR方法将4份鉴定为PCV2阳性样品进行PCV2全基因组序列扩增、测序及遗传进化分析;利用MegAlign软件对4株PCV2广东分离株ORF2氨基酸序列与国内外参考毒株进行关键位点氨基酸变异分析;应用DNAStar中Protean软件的Jameson-Wolf方法对4株PCV2广东分离株ORF2基因编码的Cap蛋白与4株疫苗株进行抗原指数预测分析。【结果】测序结果表明,4株PCV2广东分离株序列长度均为1767 bp。遗传进化树结果表明,4株分离株均属于PCV2d基因型,且核苷酸相似性在97.7%~99.1%之间,与国内外54株参考毒株相似性在91.7%~99.8%之间,其中与PhuTho/G40312/2018株(Viet Nam,登录号:LC602996)、QZ1410株(江苏,登录号:MG732832)、GXBB1501211株(广西,登录号:MH756609)亲缘关系最为接近。关键氨基酸位点变异分析表明,在Cap蛋白上有8个氨基酸特异性突变位点,分别是Y3C、F8Y、T56S、R116K、V123I、K164E、R169G及T216A。抗原指数分析发现,广东省分离株的Cap蛋白抗原指数与4株疫苗株相比差异较大,主要集中在第7-12、47-53、80-90、160-170和205-213位氨基酸这5个区域。【结论】从广东省部分地区分离的4株PCV2均为2d亚型,其Cap蛋白氨基酸序列存在多个突变位点,抗原指数与疫苗株差异较大,提示广东省PCV2的流行趋势逐渐以2d亚型为主。

摘要： 【目的】研究白细胞介素-10(IL-10)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)复制的影响,筛选PCV2高感染性细胞系和提高PCV2病毒滴度,为后续疫苗的研发及IL-10在PCV2感染中的作用研究提供参考。【方法】利用PCR技术扩增猪IL-10基因,将目的基因与慢病毒表达载体(pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro)进行连接,获得重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装。用收集的慢病毒液感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选后得到细胞株PK-15-IL-10,对照组细胞分别命名为PK-15-pCDH和PK-15。PCV2感染PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15细胞株后,在24、48和72 h分别收集细胞液,利用CCK-8检测细胞活力。利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测IL-10基因的表达水平和PCV2的复制情况;利用间接免疫荧光试验(IFA)观察PCV2在细胞中的复制情况及测定PCV2的病毒滴度(TCID50)。【结果】试验成功构建了重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞后,48 h时细胞状态最好,荧光最强。分别收集共转染48和72 h的慢病毒液上清感染PK-15细胞,pCDH-CMV-IL-10组的荧光最强,将其在嘌呤霉素浓度为2.5μg/mL的完全培养基中继续培养,获得仍有绿色荧光的稳转细胞株。实时荧光定量PCR和Western blotting检测发现,IL-10基因在pCDH-IL-10细胞株中的表达量明显高于对照组PK-15-pCDH和PK-15,PCV2的拷贝数增加了4倍,复制能力增强,且将病毒稀释连续传3代后,PK-15-IL-10细胞中的PCV2极显著高于PK-15细胞(P<0.01)。细胞增殖试验表明,猪IL-10基因在细胞中过表达对细胞活力无明显影响;IFA结果表明,PK-15-IL-10细胞中的荧光比PK-15细胞更强,PCV2在PK-15-IL-10细胞中的TCID50在感染后48 h极显著高于PK-15细胞(P<0.01)。【结论】本研究成功构建了pCDH-CMV-IL-10的慢病毒表达载体,并利用其感染PK-15细胞,继续培养后筛选出过表达IL-10的PK-15-IL-10细胞株,用PCV2感染该细胞株能促进PCV2在PK-15细胞中的复制。本试验结果为后期疫苗研究提供了参考,为进一步研究IL-10对PCV2在PK-15细胞中复制的影响奠定了基础。

摘要： 【目的】建立基于无血清悬浮培养PK-15细胞生产猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗的工艺,提高PCV2疫苗生产效率,降低PCV2疫苗生产成本。【方法】首先采用直接驯化法对贴壁生长的PK-15细胞进行无血清悬浮培养驯化,并在无血清悬浮培养体系下,采用连续传代的方法考察驯化成功的PK-15细胞的传代和生长稳定性。研究不同感染复数(MOI)(0.10、0.05、0.01和0.001)和不同PK-15细胞接种密度(CDI)(1.0×10^(6)、3.0×10^(6)、5.0×10^(6)/mL)对PCV2增殖的影响,同时对感染病毒前后的细胞培养液中葡萄糖、氨基酸及代谢副产物乳酸和氨进行初步分析。【结果】贴壁PK-15细胞经过30 d的直接驯化可以快速适应无血清悬浮培养,且驯化过程中细胞平均比生长速率由0.1 d^(-1)增加到0.6 d^(-1);悬浮PK-15细胞可以至少连续稳定传15代,连续传代过程中平均比生长速率在0.6 d^(-1)附近波动,且细胞活率始终>90%;以1.0×10^(6)/mL接种,第4天可达到峰值活细胞密度6.2×10^(6)/mL,并可维持1 d,第4天前活率均>90%,此后快速下降;病毒增殖最佳工艺参数为:感染复数为0.05,细胞接种密度为1.0×10^(6)/mL,最终收获时病毒滴度可达10^(6.2)TCID_(50)/mL;对细胞感染前后的代谢分析发现,病毒感染后细胞对葡萄糖和多数氨基酸代谢快于感染前,且感染组在感染后72 h附近出现葡萄糖和谷氨酰胺耗竭并伴随代谢副产物乳酸和氨快速积累,之后细胞改变代谢途径并利用乳酸。【结论】30 d的直接驯化可以获得悬浮PK-15细胞株,PK-15细胞可用于PCV2增殖,结果可为大规模无血清悬浮培养PK-15细胞生产PCV2疫苗提供一定理论和实践基础。

摘要： 试验旨在探索山豆根多糖(SSP)对猪圆环病毒2型(PCV2)感染小鼠脾淋巴细胞炎症因子mRNA表达的影响。试验设立细胞对照组、PCV2感染对照组以及PCV2+3种浓度(100、200和400 mg/L)的SSP药物处理组和400 mg/L的SSP药物处理组,共6组。采用PCV2体外感染小鼠脾淋巴细胞,在培养液中加入终浓度为100、200和400 mg/L的SSP,分别培养8、12和24 h后收取样品,荧光定量PCR技术测定细胞内炎性因子的mRNA表达水平。结果显示,当小鼠脾淋巴细胞培养至24 h时,PCV2感染对照组的NF-κB、MCP-1、CXCL10和STAT1的表达水平显著高于细胞对照组(P<0.05);经100、200和400 mg/L的SSP处理后,小鼠脾淋巴细胞炎症因子表达量均有所下降并呈现剂量依赖性,其中PCV2+400 mg/L SSP药物处理组的炎症因子表达量与PCV2感染对照组的相比均差异显著(P<0.05)。研究表明,SSP作用于PCV2感染的小鼠脾淋巴细胞24 h后能够降低细胞内炎症因子的mRNA表达,起到抗炎的效果。

摘要： 【目的】寻找引起某猪场母猪屡次配种不孕的原因。【方法】采集母猪饲料槽中正在食用的饲料检测黄曲霉素B含量;采集返情母猪的口鼻腔拭子、肛门拭子及血清,使用PCR、RT-PCR方法检测猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、PCV3、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(Classic swine fever virus,CSFV);随机剖检13头返情母猪,采集脾脏、淋巴结、脊髓、子宫、卵巢组织检测繁殖障碍性病毒的感染情况;对检测到的PCV2和PCV3部分阳性样品进行ORF2基因序列分析;观察母猪卵巢病理变化情况,汇总分析结果,诊断该场母猪受胎率低、持续返情的原因。【结果】该猪场饲料中黄曲霉素B含量为4.5~9.0μg/kg,均在GB 13078-2017规定的饲料中黄曲霉素B允许范围内(<20μg/kg)。PCR、RT-PCR结果显示,口鼻腔拭子、肛门拭子和血清的PCV2、PCV3、PRV、PPV、PRRSV、CSFV检测结果均为阴性;13头母猪的PCV2阳性率为69.23%(9/13),PCV3阳性率为38.46%(5/13),PCV2和PCV3混合感染率为30.76%(4/13)。实时荧光定量PCR检测结果显示,PCV2在脊髓中的病毒载量最高,脾脏次之,淋巴结中最少;PCV3在脾脏中病毒载量最高,脊髓次之,卵巢中病毒载量最少。ORF2基因序列分析发现,PCV2为2d亚型,PCV3为3a亚型。卵巢病理切片观察发现,卵泡细胞数量减少,卵泡腔形状不规则、塌陷扁平。【结论】经过诊断确定该场母猪持续返情、屡配不孕的原因是PCV2和PCV3混合感染,进而引起繁殖障碍。根据诊断结果和该场情况,采取全群接种PCV2疫苗,配合全场消毒,加强生物安全防控,成功解决该场母猪繁殖障碍问题,恢复正常生产。

摘要： 为研究西番莲多糖提取物(Passi lora edulis polysaccharide extract,PEPE)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染RAW264.7细胞氧化应激相关因子的影响,本试验探讨了PEPE对氧化应激的调节作用.在96孔细胞培养板中每孔加入100 μL浓度为1×106个/mL的RAW264.7细胞,分别设细胞对照组、PEPE组(25、50、100、200、400、800和1600μg/mL),分别于培养箱培养24和48 h,用MTT法检测细胞活性,筛选PEPE的药物安全浓度范围.试验分为以下6个组:细胞对照组、病毒组、PEPE高(400 μg/mL)、中(200 μg/mL)、低(100 μg/mL)剂量组及维生素C组,其中细胞对照组加入含10％ FBS的DMEM培养液,其余组加入PCV2病毒液,孵育2h后在PEPE组加入对应浓度的PEPE溶液,VC组加入配制好的VC溶液,细胞对照组和病毒组加入含10％ FBS的DMEM培养液,培养48 h,同样用MTT法检测细胞活性,以研究PEPE对PCV2感染RAW264.7细胞活性的影响.按照上述6个试验组分组,处理同上,将细胞培养12 h,收集样品用于检测氧化应激相关因子水平.用Griess法和DCFH-DA荧光探针分别检测RAW264.7细胞上清中NO含量和细胞内活性氧(ROS)水平、OPT荧光法检测细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量,化学发光法检测细胞内黄嘌呤氧化酶(XOD)、髓过氧化物酶(MPO)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活力.结果 显示,PEPE对RAW264.7细胞的安全浓度范围为25～400 μg/mL.PCV2感染RAW264.7细胞后,细胞活性显著降低(P＜0.05),而不同浓度PEPE处理组均能提高细胞活性.RAW264.7细胞被PCV2感染后,细胞分泌NO、ROS水平,GSSG含量及XOD、MPO和iNOS活性显著升高(P＜0.05),感染细胞GSH含量显著降低(P＜0.05);PEPE作用于PCV2感染的RAW264.7细胞,显著降低感染细胞NO、ROS水平、GSSG含量及XOD、MPO和iNOS活性(P＜0.05),100 μg/mL PEPE处理组细胞GSH水平显著升高(P＜0.05).本试验结果表明,PEPE能提高PCV2感染RAW264.7细胞的抗氧化能力,有利于缓解病毒感染所致氧化应激.

摘要： 为了解苏中地区猪群猪圆环病毒2型(PCV2)感染情况及疫苗免疫效果,采集了苏中地区的15个养猪场363份样本,采用荧光定量PCR检测猪组织标本中的PCV2,使用间接ELISA检测猪血清中的PCV2抗体.结果表明,调查猪场的PCV2感染率为10.7％,其中大、中、小型猪场的感染率分别为4.9％、7.1％和18.8％,仔猪、母猪和肥育猪的感染率分别为2.3％、9.4％和16.9％.猪PCV2抗体阳性率为90.4％,其中大、中、小型猪场分别为94.1％、89.6％、88.2％,仔猪、母猪、育肥猪分别为80.0％、92.6％、95.1％.研究表明,苏中地区猪群存在PCV2感染,其中小型猪场与育肥猪感染率最高.

摘要： 为确定河南开封某猪场发生猪呼吸系统疾病综合征(PRDC)的病原,本研究无菌采集病死保育猪肺脏、心脏和脾脏等组织样品,进行细菌学检验和药敏试验,通过PCR/RT-PCR检测样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流感病毒(SIV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪肺炎支原体(Mhp)等病原,并对核酸阳性病毒性病原的抗原结构基因进行测序和遗传演化分析.结果 表明,通过细菌分离培养、形态观察、卫星现象观察和16S rRNA基因鉴定,从病死保育猪体内分离鉴定出1株副猪嗜血杆菌(Hps),药敏实验表明该菌株对对氨苄西林、阿莫西林克拉维酸、头孢噻呋和四环素几种药物敏感.核酸检测PRRSV和PCV2核酸阳性,分别命名为PRRSV/HN-2019和PCV2/HN11-2019;进一步对PRRSV/HN-2019和PCV2/HN11-2019的结构基因分析发现,PRRSV/HN-2019与与NADC30分支的毒株亲缘关系较近,属于NADC30-1ike毒株;PCV2/HN11-2019与PCV-2d分支的毒株亲缘关系较近,属于PCV-2d分支.综上所述,本研究确定该猪场存在PRRSV、PCV2和Hps的混合感染,为该猪场下一步的PRDC有效防控提供了参考依据.

摘要： 为了掌握浙江地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)流行病学特点和遗传变异情况,应用PCR检测方法,对2018年浙江地区猪场采集的临床疑似病料进行PCV2检测,并对部分阳性病料进行全基因扩增、克隆、序列测定和ORF2遗传进化树分析.结果显示:329份临床疑似样品中,PCV2阳性率27.4％(90/329),其中宁波地区阳性率最高,为52％;保育猪和肥育猪阳性率最高,分别为38.8％(64/165)和68.8％(11/16).选取7份病料进行全基因组扩增,每个毒株随机挑选3个或4个阳性克隆进行序列测定,共得到22个毒株进行遗传变异分析.22株病株同源性为93.3％ ～99.8％,与16个参考毒株同源性为93.5％ ～99.8％.根据遗传进化树分析,22个毒株分别处于3个分支,其中6株PCV2a,6株PCV2b,10株PCV2d,说明目前浙江地区PCV2d是优势毒株.ORF2遗传进化树分析显示,ORF2核苷酸同源性较全基因组核苷酸同源性低,3个分支分别处于PCV2b、PCV2d和PCV2e,预示浙江地区流行毒株可能在向PCV2e转变.本研究掌握了PCV2在浙江地区的流行动态,为浙江省PCV2疫苗株的选择和疫苗研发提供了理论依据.

摘要： 选择上海闪晶分子生物科技有限公司、南京诺维赞生物科技有限公司、北京蓝谱生物科技有限公司的Bst酶和LAMP反应缓冲液,进一步对猪圆环病毒2型(PCV2)环介导等温扩增(LAMP)试剂盒的原材料进行了研究.结果表明:南京诺维赞生物科技有限公司的试剂较好,该厂家的原材料可实现试剂盒检测性能的最优化.该组合灵敏度高,阳性参考品稀释度为10-11(5个病毒/μL)可进行反应,且特异性较好.本研究可为后续药证申报奠定基础,同时为其他相关LAMP诊断试剂盒的药证申报提供参考.

摘要： 本研究对川渝两地6个疑似PCV-2和PRRSV混合感染的发病猪场分别进行PCR和RT-PCR诊断。结果显示,PRRSV均为阳性,PCV部分为阳性,从而证实了PCV-2和PRRSV在猪体内的混合感染。

摘要： 本研究对川渝两地6个疑似PCV-2和PRRSV混合感染的发病猪场分别进行PCR和RT-PCR诊断。结果显示,PRRSV均为阳性,PCV部分为阳性,从而证实了PCV-2和PRRSV在猪体内的混合感染。

摘要： 本研究对川渝两地6个疑似PCV-2和PRRSV混合感染的发病猪场分别进行PCR和RT-PCR诊断。结果显示,PRRSV均为阳性,PCV部分为阳性,从而证实了PCV-2和PRRSV在猪体内的混合感染。

摘要： 本发明提供了一种猪圆环病毒2型与3型二价灭活疫苗及其制备方法，含有灭活的猪圆环病毒2型和3型以及疫苗佐剂；其中猪圆环病毒2型与3型的含量分别至少为10

摘要： 本发明公开了猪圆环病毒Ⅱ型‑猪塞尼卡谷病毒二联灭活疫苗抗原的制备方法，1）将培养至单层的BHK‑21细胞用胰酶消化，然后加入MEM营养液终止消化，细胞计数后稀释为密度为2×104个/mL的BHK‑21细胞悬液；2）将猪圆环病毒Ⅱ型接种BHK‑21细胞悬液中，培养48h后更换细胞维持液并同时接种猪塞尼卡谷病毒，继续培养；3）接种两种病毒抗原的BHK‑21细胞培养24h左右，根据细胞病变情况收获细胞，收获细胞后的病毒液反复冻融后置于‑40°C以下环境中储存。本发明将猪圆环病毒Ⅱ型和猪塞尼卡谷两种病毒先后都接种于同一种细胞中进行培养，根据细胞病变程度决定抗原收获时间，生产猪圆环病毒Ⅱ型‑猪塞尼卡谷病毒二联灭活苗抗原，提高了生产效率，节约了生产成本，提升了产品质量。

摘要： 本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二联疫苗及应用，所述的二联疫苗包括灭活的猪伪狂犬病病毒XF‑1株和猪圆环病毒2型‑WH株。本发明提供的二联灭活疫苗证实XF‑1株可与其他本研究领域所熟知抗原制备成两种或两种以上疾病的联合疫苗，改变了人们对猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒同时感染时的认识偏见，首次将猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒抗原按照合适的比例联合使用取得良好效果，具有很好的疫苗开发前景。

摘要： 本发明提供了一种猪圆环病毒2型与3型二价灭活疫苗及其制备方法，含有灭活的猪圆环病毒2型和3型以及疫苗佐剂；其中猪圆环病毒2型与3型的含量分别至少为10

摘要： 本发明公开了一种同时检测猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的PCR方法，分别以PCV3和PCV2基因组的保守区域设计两对特异性引物，建立了二重PCR检测方法检测方法，以实现对猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型快速准确检测并鉴定的目的。

摘要： 本发明专利涉及农业技术领域内的诊断技术。通过自行设计特异性引物L1、L2、L3，提取病毒DNA，在此基础上利用PCR方法鉴别检测猪圆环病毒不同血清型，扩增猪圆环病毒II型(PCV2)预计扩增片段大小为404bp，扩增猪圆环病毒I型(PCV1)预计扩增片断大小为198bp。并在此基础上研制成功了专用试剂盒，与现有技术相比该诊断方法和专用试剂盒具有很强的特异性、敏感性，与病毒分离和IFA等方法相比符合率可达90％以上。该引物对猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒的扩增结果均为阴性，可广泛用于临床和实验室圆环病毒的检测。

摘要： 本发明公开了猪圆环病毒Ⅱ型‑猪塞尼卡谷病毒二联灭活疫苗抗原的制备方法，1）将培养至单层的BHK‑21细胞用胰酶消化，然后加入MEM营养液终止消化，细胞计数后稀释为密度为2×104个/mL的BHK‑21细胞悬液；2）将猪圆环病毒Ⅱ型接种BHK‑21细胞悬液中，培养48h后更换细胞维持液并同时接种猪塞尼卡谷病毒，继续培养；3）接种两种病毒抗原的BHK‑21细胞培养24h左右，根据细胞病变情况收获细胞，收获细胞后的病毒液反复冻融后置于‑40°C以下环境中储存。本发明将猪圆环病毒Ⅱ型和猪塞尼卡谷两种病毒先后都接种于同一种细胞中进行培养，根据细胞病变程度决定抗原收获时间，生产猪圆环病毒Ⅱ型‑猪塞尼卡谷病毒二联灭活苗抗原，提高了生产效率，节约了生产成本，提升了产品质量。

摘要： 本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二联疫苗及应用，所述的二联疫苗包括灭活的猪伪狂犬病病毒XF‑1株和猪圆环病毒2型‑WH株。本发明提供的二联灭活疫苗证实XF‑1株可与其他本研究领域所熟知抗原制备成两种或两种以上疾病的联合疫苗，改变了人们对猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒同时感染时的认识偏见，首次将猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒抗原按照合适的比例联合使用取得良好效果，具有很好的疫苗开发前景。

摘要： 本发明涉及预防和治疗猪传染病的多价疫苗，特别涉及治疗和预防猪圆环病毒2型和猪细小病毒的组合疫苗及其制备方法。本发明选用猪圆环病毒2型和猪细小病毒，制备方法如下：培养猪圆环病毒2型，并灭活、浓缩；培养猪细小病毒，并灭活、浓缩；将上述2种抗原成分按比例混合，辅以佐剂制备成疫苗。本发明制备获得的二联疫苗使用方便，更为安全，而且免疫效果优于单独两种单苗联用。

摘要： 本发明涉及预防和治疗猪传染病的多价疫苗，特别涉及治疗和预防猪圆环病毒2型和猪细小病毒的组合疫苗及其制备方法。本发明选用猪圆环病毒2型和猪细小病毒，制备方法如下：培养猪圆环病毒2型，并灭活、浓缩；培养猪细小病毒，并灭活、浓缩；将上述2种抗原成分按比例混合，辅以佐剂制备成疫苗。本发明制备获得的二联疫苗使用方便，更为安全，而且免疫效果优于单独两种单苗联用。