抗CAMK2A自身抗体的试剂在制备诊断神经系统症状相关疾病的试剂盒中的应用

摘要

本发明涉及抗CAMK2A自身抗体的试剂在制备诊断神经系统症状相关疾病的试剂盒中的应用，属于疾病诊断试剂盒技术领域。本发明提供了抗CAMK2A自身抗体的试剂在制备诊断神经系统症状相关疾病的试剂盒中的应用。本发明所述应用制备得到的试剂盒能够实现CAMK2A自身抗体的检测，并且可以用来诊断神经系统疾病，尤其是与一种或多种症状相关的神经系统疾病，所述症状包括睡眠障碍、嗜睡、抑郁、认知和精神异常、自主神经功能障碍、癫痫发作、意识水平下降、意识模糊。本发明所述应用制备得到的试剂盒还可以用来区分自身免疫疾病，尤其是区分神经系统的自身免疫疾病与非自身免疫疾病。

说明书

技术领域

本发明涉及疾病诊断试剂盒技术领域，具体涉及抗CAMK2A自身抗体的试剂在制备诊断神经系统症状相关疾病的试剂盒中的应用。

背景技术

自身免疫性脑炎(autoimmune encephalitis，AE)泛指一类由自身免疫机制介导的脑炎，是一种由抗体介导的损伤以及造成神经元结构功能障碍的中枢神经系统炎症，其抗体包括抗神经元细胞内抗原抗体(产生副肿瘤综合征)及抗神经元细胞表面抗原抗体。

现有的文献报道及临床上检测的自身免疫性脑炎抗体谱包括：N-甲基-D 天冬氨酸受体(NMDAR)、α-氨基-3羟基-5甲基-4异恶唑受体(AMPAR)、富含亮氨酸的神经胶质瘤失活蛋白1(LGI1)、接触蛋白相关蛋白-2 (CASPR2)、γ-氨基丁酸受体B(GABABR)、二肽基肽酶样蛋白-6(DPPX)、 IgLON家族蛋白5(IgLON5)、甘氨酸受体(GlyR)、代谢型谷氨酸受体5(mGluR5)、多巴胺D2受体(D2R)、轴突蛋白3α(Neurexin3α)、谷氨酸脱羧酶65(GAD65)等。目前，虽然在自免性脑炎患者中识别自身抗体介导的免疫机制方面取得了进展，但仍有一部分表现出脑炎症状的患者血清学检测结果为阴性，因此，鉴定与自身抗体结合的新抗原，提高现有的诊断和治疗水平，仍是一项艰巨的任务。

发明内容

本发明的目的在于提供抗CAMK2A自身抗体的试剂在制备诊断神经系统症状相关疾病的试剂盒中的应用。本发明所述应用制备得到的试剂盒能够实现CAMK2A自身抗体的检测，并且可以用来诊断神经系统疾病，尤其是与一种或多种症状相关的神经系统疾病，所述症状包括睡眠障碍、嗜睡、抑郁、认知和精神异常、自主神经功能障碍、癫痫发作、意识水平下降、意识模糊。本发明所述应用制备得到的试剂盒还可以用来区分自身免疫疾病，尤其是区分神经系统的自身免疫疾病与非自身免疫疾病。

本发明提供了抗CAMK2A自身抗体的试剂在制备诊断神经系统症状相关疾病的试剂盒中的应用。

优选的是，抗CAMK2A自身抗体的试剂包括CAMK2A蛋白，或能够表达所述CAMK2A蛋白的载体或细胞，或含所述CAMK2A蛋白的组织。

优选的是，所述CAMK2A蛋白包括如下蛋白质(a)或(b)的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的CAMK2A蛋白；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有与CAMK2A自身抗体结合功能的由(a)衍生的蛋白质。

优选的是，所述蛋白质(b)包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

优选的是，所述神经系统症状包括睡眠障碍、嗜睡、抑郁、认知和精神异常、自主神经功能障碍、癫痫发作、意识水平下降和意识模糊中的一种或两种以上。

优选的是，所述疾病包括神经系统自身免疫疾病。

优选的是，所述疾病包括自身免疫性脑炎。

本发明还提供了一种检测CAMK2A自身抗体的试剂盒，所述试剂盒包括抗CAMK2A自身抗体的试剂，所述抗CAMK2A自身抗体的试剂包括 CAMK2A蛋白，或能够表达所述CAMK2A蛋白的载体或细胞，或含所述 CAMK2A蛋白的组织。

优选的是，所述CAMK2A蛋白包括如下蛋白质(a)或(b)的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的CAMK2A蛋白；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有与CAMK2A自身抗体结合功能的由(a)衍生的蛋白质。

优选的是，所述蛋白质(b)包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

本发明提供了抗CAMK2A自身抗体的试剂在制备诊断神经系统症状相关疾病的试剂盒中的应用。本发明所述应用制备得到的试剂盒能够实现 CAMK2A自身抗体的检测，并且可以用来诊断神经系统疾病，尤其是与一种或多种症状相关的神经系统疾病，所述症状包括睡眠障碍、嗜睡、抑郁、认知和精神异常、自主神经功能障碍、癫痫发作、意识水平下降、意识模糊。本发明所述应用制备得到的试剂盒还可以用来区分自身免疫疾病，尤其是区分神经系统的自身免疫疾病与非自身免疫疾病。

附图说明

图1为本发明提供的患者1血清在大鼠原代神经元上的免疫荧光法染色结果图；

图2为本发明提供的血清CAMK2A免疫沉淀结果图；

图3为本发明提供的血清免疫沉淀物的WB鉴定结果图；

图4为本发明提供的大鼠小脑组织的免疫组化染色结果图；

图5为本发明提供的大鼠小脑组织的免疫组化共染结果图；

图6为本发明提供的大鼠小脑组织的免疫组化中和实验结果图；

图7为本发明提供的CBA法检测样受试者样本中的自身抗体结果图；

图8为本发明提供的患者1血清的CBA法中和实验图；

图9为本发明提供的患者2血清的CBA法中和实验图。

具体实施方式

本发明提供了抗CAMK2A自身抗体的试剂在制备诊断神经系统症状相关疾病的试剂盒中的应用。

在本发明中，抗CAMK2A自身抗体的试剂包括CAMK2A蛋白，或能够表达所述CAMK2A蛋白的载体或细胞，或含所述CAMK2A蛋白的组织。本发明所述CAMK2A蛋白优选指的是能与CAMK2A自身抗体结合的具有免疫原性的多肽；本发明所述“多肽”应理解为2个、3个、4个、5个、6 个、7个、8个、10个、12个20个、30个、40个、50个、60个、70个或更多个氨基酸的聚合物。本发明所述多肽也可以理解为它包含衍生自蛋白 CAMK2A的一个或更多个表位。在本发明中，所述多肽优选还包括融合了 CAMK2A和其他氨基酸的融合蛋白，所述氨基酸优选连接在N端或C端，具有促进所述多肽或蛋白质的纯化、固定化、沉淀或鉴定的作用，所述氨基酸可以构成本领域已知的标签，例如，His标签、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、flag标签、myc标签或strep标签。本发明对所述多肽的来源没有特殊限定，采用重组多肽和/或纯化分离得到的多肽均可。在本发明中，所述CAMK2A蛋白的载体或细胞优选为含有编码CAMK2A 蛋白的核酸。更优选的，所述载体优选能够使得本发明的蛋白的表达量提高和/或增加本发明蛋白的可溶性。本发明所述含所述CAMK2A蛋白的组织优选的来自哺乳动物脑，例如，人、大鼠、灵长类动物、小鼠、山羊、马、绵羊或牛的脑组织；这样的组织也可以构成用于检测CAMK2A自身抗体的试剂盒。

本发明所述试剂能够检测出来自患者的样品中的与CAMK2A蛋白结合的CAMK2A自身抗体。具体的，本发明优选利用所述试剂与CAMK2A自身抗体结合，实现疾病的诊断。只要检测出CAMK2A自身抗体，则诊断为患有神经系统症状相关疾病。即本发明所述患者为患有新型自身免疫性疾病的患者，这些患者为有与抗CAMK2A抗体有关的睡眠障碍、嗜睡、抑郁、认知和精神异常、自主神经功能障碍、癫痫发作、意识水平下降、意识模糊症状的患者。在本发明中，所述结合优选包括以下步骤：

a)将包含自身抗体的样品与包含CAMK2A蛋白接触，形成复合物；

b)使用辣根过氧化物酶、化学发光分子、荧光染料或放射性同位素等其他可被检测的形式标记的抗体进行再次孵育；

c)使用检测系统观察记录检测结果。

本发明对所述样品的来源没有特殊的限定，所述样品优选是包含抗体的体液，所述体液优选的选自全血、血清或脑脊液。

在本发明中，所述CAMK2A蛋白优选是固定化的，更优选固定化于固态载体上。

本发明所述的CAMK2A，优选指的是哺乳动物CAMK2A，更优选指的是人CAMK2A。在本发明中，所述CAMK2A蛋白包括如下蛋白质(a)或 (b)的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO.1(人的CAMK2A的蛋白质，编码此蛋白的基因的核苷酸序列如SEQID NO.4所示)或SEQ ID NO.2(大鼠的CAMK2A蛋白，编码此蛋白的基因的核苷酸序列如SEQID NO.5所示)所示的CAMK2A蛋白；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有与CAMK2A自身抗体结合功能的由(a)衍生的蛋白质。

在本发明中，所述蛋白质(b)序列优选具有与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

在本发明中，所述蛋白质(b)更优选包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

在本发明中，所述神经系统症状包括睡眠障碍、嗜睡、抑郁、认知和精神异常、自主神经功能障碍、癫痫发作、意识水平下降和意识模糊中的一种或两种以上。CAMK2A蛋白的自身抗体可以在来自患有上述症状的患者样品中检出，而在健康受试者的样品中检不出。这种自身抗体的存在表明，具有CAMK2A自身抗体的患者中与CAMK2A相关的功能受到损伤，从而出现神经系统症状。

在本发明中，所述疾病包括神经系统自身免疫疾病。

在本发明中，所述疾病包括自身免疫性脑炎。

本发明还提供了一种检测CAMK2A自身抗体的试剂盒，所述试剂盒包括抗CAMK2A自身抗体的试剂，所述抗CAMK2A自身抗体的试剂包括 CAMK2A蛋白，或能够表达所述CAMK2A蛋白的载体或细胞，或含所述 CAMK2A蛋白的组织。

在本发明中，所述CAMK2A蛋白包括如下蛋白质(a)或(b)的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的CAMK2A蛋白；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有与CAMK2A自身抗体结合功能的由(a)衍生的蛋白质。

在本发明中，所述蛋白质(b)包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

本发明对所述试剂盒的诊断方法没有特殊限定，在本发明中，所述体外诊断方法优选包括：使来自受试者的样品与本发明的抗CAMK2A自身抗体的试剂接触，检测来自该样品的抗体。在本发明中，所述体外诊断方法包括免疫荧光检测、蛋白质微阵列、ELISA、发光检测(luminescence-test)、放射免疫检测、蛋白质印迹法或斑点印迹法。在本发明中，所述样品优选是含有抗体的离体样本。例如，所述样品可以是液体样品，如脑脊液、血液或血浆、淋巴液或组织间液或组织样品，组织样品可以是神经组织。

下面结合具体实施例对本发明所述的抗CAMK2A自身抗体的试剂在制备诊断神经系统症状相关疾病的试剂盒中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

术语解释：

在本发明的范围内，“表位”是能够被抗体特异性识别的多肽的一部分。所述表位可以是构象表位(由多肽的不连续氨基酸序列组成)或线性表位(由多肽的连续氨基酸序列组成)。

在本发明的范围内，对于表位，术语“衍生的”涉及由多肽或蛋白质的一级氨基酸序列的不连续或连续部分形成的表位。本领域已知的是，表位中的一个或更多个氨基酸可以被取代。因此，术语“衍生的”还涉及这样的表位：当与具有原始氨基酸序列的表位相比，尽管在氨基酸序列上具有差异，所述表位表现出不变的或基本上不变的抗体结合强度或特异性。

根据本发明，“核酸”涉及DNA或RNA序列。本领域已知的是，由于遗传密码的简并性，核酸编码的某些变化不会导致其所编码的肽序列的变化。因此，术语“核酸”还包含编码相同蛋白序列、与原始核酸序列在序列上存在不同的核酸序列，即该原始序列的突变序列。

根据本发明，“载体”包括插入物(例如编码所需蛋白质的原始或突变核酸序列)和其它特征(启动子、多克隆位点、筛选标记、复制子等)的环状或线性核酸序列。这样的载体包括pTriEx载体家族、pcDNA3家族、pET 系列、pBac系列等其他商品化的真核表达系统或原核表达系统的载体。

根据本发明，“细胞”是能够转入载体的任何原核或真核宿主细胞。例如，细胞可以是细菌细胞(如大肠杆菌细胞)或真核细胞(如永生化人细胞，昆虫细胞，酵母)。这样的细胞包括HEK293细胞、Hela细胞、CHO、毕赤酵母、酿酒酵母、sf9、BL21、Rosetta等本领域技术人员常用的细胞。

本发明范围内的“固定”指这样的分子，其与水溶液中不可溶的固态载体结合、更优选地借助共价键、静电相互作用、囊化或包埋或借助疏水相互作用，最优选地借助一个或多个共价键结合。例如载玻片、聚苯乙烯板、玻璃板、膜(尼龙膜、硝酸纤维素膜或PVDF膜)、磁珠、柱色谱介质、生物芯片、聚丙烯酰胺凝胶等。

实施例中的患者信息

患者1和患者2的血清为医院赠予，对患者的血清进行探索性研究，已征求过患者的同意。

患者1：63岁，女性，有高血压病史，患有睡眠障碍5年以上，因近一年来精神状态不佳，表现出明显的抑郁倾向且认知能力下降而住院，血常规、尿液及粪便的生化指标均正常，全身CT扫描未发现癌症，给予抗抑郁药物治疗6个月后症状未见好转，因抑郁症加重，且出现记忆力下降的情况再次入院进行治疗，脑脊液寡克隆区带阳性，此时，医生怀疑其患有神经系统自身免疫性疾病，将其样本送往检验科，经检测，该样本副肿瘤14项(包括 Ri、Hu、Yo、CV2、Ma2、Amphiphysin、Titin、Ma1、SOX1、Tr、Zic4、 PKCγ、Recoverin、GAD65)阴性，自免性脑炎15项(包括NMDAR、AMPAR1、 AMPAR2、LGI1、CASPR2、GABABR、DPPX、IgLON5、GlyR、GABAARα1、 GABAARγ2、GABAARβ3、mGluR5、D2R、Neurexin3α)阴性，中枢脱髓鞘病变6项(AQP4、MBP、MOG、GFAP、AQP1、Flotillin1/2)阴性，外周神经病1项(GQ1b IgG和GQ1b IgM)阴性。

患者2：51岁，女性，因意识水平下降，记忆减退至医院神经科门诊就诊。据患者丈夫描述，该患者患有抑郁症，2周前，患者开始出现头痛、心悸、气促、大汗，1天前，患者出现癫痫症状，肢体抽搐，故来医院就诊，脑脊液细胞学淋巴细胞性炎症，随后，医生将其样本送往检验科，经检测，该样本副肿瘤14项(包括Ri、Hu、Yo、CV2、Ma2、Amphiphysin、Titin、 Ma1、SOX1、Tr、Zic4、PKCγ、Recoverin、GAD65)阴性，自免性脑炎15 项(包括NMDAR、AMPAR1、AMPAR2、LGI1、CASPR2、GABABR、 DPPX、IgLON5、GlyR、GABAARα1、GABAARγ2、GABAARβ3、mGluR5、 D2R、Neurexin3α)阴性，中枢脱髓鞘病变6项(AQP4、MBP、MOG、GFAP、AQP1、Flotillin1/2)阴性，外周神经病1项(GQ1bIgG和GQ1bIgM)阴性。

健康受试者血清来自于医院体检中心赠送的健康体检者血清，已经体检者本人同意。

实施例1

大鼠原代神经元细胞的免疫荧光法

步骤1大鼠原代神经元细胞分离

1、10％水合氯醛麻醉孕鼠，75％酒精浸泡消毒3min，生物安全柜取出胎鼠；

2、用预冷的HBSS(137mM NaCl，5.4mM KCl，0.6mM MgSO

3、弃DMEM，用眼科剪将组织块剪成1m

4、消化结束后，将细胞移到50ml离心管，加入20ml DMEM重悬，1 ml枪头吹打10次，400g，4℃离心5min，

5、弃上清液，加入20ml DMEM重悬，1ml枪头吹打10次，4℃，400 g离心5min，该步骤重复1次；

6、弃上清液，加入20ml Neurobasal培养基重悬细胞。

步骤2、梯度密度法分离纯化神经元细胞

本实验所采用密度介质的密度为A，即1.32g/ml的OptiPrep(为Percoll 的优化产品)

1、取细胞混合原液2ml，并用B，即Neurobasal+B27+L-glutamine的全培养基稀释至6ml；

2、配制梯度密度介质，①：173μl A+827μl B；②：124μl A+876μl B；③：99μl A+901μl B；④：74μl A+926μl B，并按照①②③④的顺序依次加入到15ml离心管底部；

3、将样本加入到介质顶层；

4、800g，22℃，15min离心分离；

5、依次去除上层6ml细胞碎片部分和1ml神经元细胞和少突胶质细胞混合细胞；

6、从离心管上层取体积大约为2.5ml的神经元细胞悬液，作为后续实验材料。

7、取出神经元细胞后，用5ml的Neurobasal+B27+L-glutamine的全培养基进行稀释；

8、200g，22℃，2min离心，去除上清；

9、使用全培养基洗涤一次；

10、加入5ml Neurobasal+B27+L-glutamine的全培养基重悬；

11、血球计数板计数后按每孔约60000细胞接种至48孔板中，然后将 48孔板置于培养箱中进行培养，5～7天备用。

步骤3、

1、将步骤2长有神经元细胞的48孔板从培养箱中拿出，弃上清， 1×HEPES洗2次；

2、使用0.4％的多聚甲醛固定10min，弃上清，1×HEPES洗2次；

3、使用1.25M甘氨酸浸泡10min，弃上清，1×HEPES洗2次；

4、血清孵育：将患者1的血清使用PBS按照1:10的比例进行稀释，并将稀释好的样本加至含有神经元细胞的孔中，室温孵育60min，弃上清， 1×HEPES洗3次；

5、二抗孵育：使用荧光标记的二抗室温孵育40min，弃上清，1×HEPES 洗3次；

6、拍照：荧光显微镜下进行拍照，使用大鼠神经元细胞对患者血清和健康受试者血清进行免疫荧光测定，结果如图1所示，图1为患者1血清在大鼠原代神经元上的免疫荧光法染色结果，其中，A:患者1血清；B健康受试者血清。

实验结果：

由图1可以看出，患者血清中存在与大鼠原代神经元结合的抗体，而健康受试者的血清未检出与神经元结合的抗体。

实施例2

CAMK2A的免疫沉淀

本实施例的免疫沉淀实验所用的血清有3个，分别是患者1的血清、健康受试者1和健康受试者2的血清，共得到三种洗脱液。具体实验步骤如下：

1、取6皿大鼠原代神经元细胞，弃上清，PBS洗2遍，0.4％多聚甲醛固定10min，弃上清，1×HEPES洗3次；

2、血清孵育：取10ul血清加至10ml DMEM中(1:100稀释)，用0.22um 滤膜过滤后将滤液加至已固定好的细胞中，室温孵育2h；

3、取15ul GE公司的proteinA加入到2mL离心管中，平衡液(20mM Na

4、将孵育好的细胞置于冰上，弃上清，PBS洗2遍，加入500ul裂解液(150mM NaCl，1mM EDTA，100mM Tris-HCl，0.5％脱氧胆酸钠，1％TritonX-100，0.1％SDS，pH7.5)，收集细胞，加入终浓度为1×cocktail(罗氏公司)，裂解30min，间隔震荡，15000rpm离心30min，取上清，测浓度；

5、将步骤4收集的上清加入到步骤3处理好的proteinA中，4℃过夜旋转孵育；

6、洗脱：用裂解液将孵育好的proteinA洗涤4次，再用80ul 2*loading buffer洗脱；

7、样本处理：洗脱液中先加入5×SDS-PAGE loading buffer，再加入终浓度为0.01M的DTT，100℃加热10min，最后加入终浓度为2％的碘乙酰胺，室温放置30min；

8、电泳：将处理好的样品跑胶，使用银染试剂盒进行染色，分析结果 (银染试剂盒购自于thermo公司)。

实验结果：

图2为本发明提供的血清CAMK2A免疫沉淀结果图，根据图2可知，在用患者1血清获得的来自大鼠神经元的免疫沉淀物中检出一种大约 50～70KD的蛋白质(图2泳道1)，该蛋白质不存在于类似制备的对照中(图 2泳道2(健康受试者1)和泳道3(健康受试者2))。

实施例3

免疫印迹

1、电泳：取实施例2步骤7处理后的样品进行SDS-PAGE；

2、转膜：电泳完成后，使用湿法转膜，转膜条件为200mA，80min；

3、封闭：使用5％的脱脂奶粉室温封闭1h；

4、一抗孵育：按照1:2000的比例孵育抗CAMK2A的多克隆抗体(抗体购自于sigma公司)，室温孵育2h；

5、洗涤：TBST洗3次，每次5min；

6、二抗孵育：加入HRP标记的二抗，室温孵育1h

7、洗涤TBST洗3次，每次5min；

8、显色：加入化学发光液，记录结果。

实验结果：

图3为血清免疫沉淀物的WB鉴定结果图，其中，M:marker；1:上样样品为患者血清免疫沉淀物；2:上样样品为健康受试者血清免疫沉淀物。由图 3可以看出，用患者血清捕获到的免疫沉淀物中存在与CAMK2A抗体反应的条带，目的蛋白带处于55KD处，而健康受试者的免疫沉淀物中无条带出现，证明该患者体内存在与神经元蛋白反应的抗体。

实施例4

大鼠脑组织的免疫组化

步骤1取组织，切片

1、选成年大鼠，麻醉，待老鼠四肢硬化，打开腹腔，暴露出心尖，从左心尖灌注PBS，以便全身循环；

2、取出脑组织；

3、甲醇固定10～30min；

4、脱水：将样本移入30％蔗糖溶液中，4℃放置至组织块沉底；

5、将少量包埋剂OCT滴加到标本台，置入-20℃冷冻切片机的冷冻台。待组织略微发白时用OCT在标本表面涂一薄层，继续冷冻20min，切片；

步骤2大鼠脑组织免疫组化片子的染色

1、一抗孵育：按照1:10的比例孵育患者1的血清，室温孵育1h；

2、洗涤：PBST洗3次，每次5min；

3、二抗孵育：加入荧光标记的二抗，室温孵育1h；

4、洗涤：PBST洗3次，每次5min；

5、显微镜下观察结果，拍照。

步骤3抗体共染实验验证大鼠脑组织上的信号

1、取步骤2拍照后的组化片子，加入CAMK2A抗体(1:200稀释)，室温孵育40min；

2、洗涤：PBST洗3次，每次5min；

3、显微镜下观察结果，拍照。

步骤4血清中和实验验证鼠脑组织上的信号

1、中和蛋白的制备：收集过表达CAMK2A蛋白的HEK293细胞(构建方法详见实施例6)1皿(10cm皿)，加入200ul PBS，超声破碎(破碎条件为：15％功率，破3s，停6s，共超声3次)；对照细胞为转入空载pCDNA3.1 的细胞，对照蛋白的制备条件与CAMK2A中和蛋白的制备条件相同；

2、中和实验：

(1)按照1:10的比例用PBST稀释患者血清，稀释好的血清中分别加入20ul CAMK2A中和蛋白及对照蛋白，正常组加入20ul PBST，室温孵育 10min；

(2)样本孵育：将上述孵育好的样本加至鼠脑组织爬片上，室温孵育 1h；

(3)洗涤：PBST洗3次，每次5min；

(4)二抗孵育：加入荧光标记的二抗，室温孵育1h；

(5)洗涤：PBST洗3次，每次5min；

(6)显微镜下观察结果，拍照。

实验结果：

(1)步骤2大鼠脑组织免疫荧光染色结果

图4为大鼠小脑组织的免疫组化染色结果图，其中，A：患者1血清染色；B：健康受试者血清染色。图4可以看出，与健康受试者血清染色结果相比，患者血清在大鼠小脑组织上分子层及浦肯野细胞层均有明显的信号。

(2)步骤3大鼠脑组织上患者1血清与CAMK2A抗体共染结果

图5为大鼠小脑组织的免疫组化共染结果图，其中，A:患者1血清样本染色；B:CAMK2A抗体染色；C:图A与图B merge结果。

(3)步骤4血清中和实验验证鼠脑组织上的信号结果

图6为大鼠小脑组织的免疫组化中和实验结果图，其中，A:加PBST中和血清；B:加入CAMK2A蛋白中和血清；C:加入对照蛋白中和血清。由图 6可以看出，CAMK2A中和蛋白明显减弱了患者1血清在鼠脑组织分子层及浦肯野细胞层出现的信号，而对照蛋白未减弱组织上出现的信号，中和实验结果表明患者1血清在鼠脑组织分子层及浦肯野细胞层上染出的信号为鼠脑 CAMK2A抗原的特异性信号。

实施例4结论：患者1的血清中存在与鼠脑中CAMK2A蛋白相结合的特异性抗体。

实施例5

质谱法

从实施例2的凝胶上切下泳道1箭头所指的蛋白条带送去拜谱生物进行质谱法分析。

结果：靶抗原与患者1的血清首先进行免疫沉淀，然后通过SDS-PAGE 电泳分离蛋白质，再进行凝胶银染。从银染胶上切下正常血清无而患者血清有的条带，送拜谱生物进行质谱分析。质谱结果证实所切条带含有CAMK2A 序列。

实施例6

HEK293细胞的免疫荧光法检测抗人CAMK2A自身抗体

步骤1重组载体的构建

通过PCR或人工合成的方法，将人的CAMK2A基因通过分子克隆方法连至pCDNA3.1上，得到重组载体pCDNA3.1-CAMK2A，构建好的重组载体经测序正确后大提备用；

步骤2细胞转染

(1)293T细胞培养：DMEM高糖培养基与FBS按9:1比例配制成10％ FBS-DMEM高糖培养基，待细胞铺满时按1:5～1:6传代，置37℃，5％CO

(2)待细胞密度为30％～40％时，将pCDNA3.1-CAMK2A转入细胞中；

步骤3爬片固定

(1)洗涤：将生长48h的细胞用PBS洗涤2次，

(2)固定：加入丙酮固定5min；

(3)洗涤：丙酮固定后的爬片用PBS洗涤2次，干燥后备用。

步骤4患者血清染色

(1)爬片洗涤：使用PBST洗涤步骤3获得的细胞爬片；

(2)样本孵育：将患者1的血清按照1:10比例稀释后加至爬片上，室温孵育1h；

(3)洗涤：PBST洗3次，每次5min；

(4)二抗孵育：加入荧光标记的二抗，室温孵育40min；

(5)洗涤：PBST洗3次，每次5min；

(6)显微镜下观察结果，拍照。实验结果：

图7为CBA法检测样受试者样本中的自身抗体结果图，其中，A:患者 1血清染色；B健康受试者血清染色。图7可以看出，与健康受试者血清染色结果相比，患者血清在表达CAMK2A抗原的细胞爬片上有明显的信号。

步骤5血清中和实验验证细胞爬片上的的信号

患者1和患者2的血清在过表达CAMK2A的细胞爬片上出现了比健康受试者血清明显的信号，为了进一步验证该信号的真实性，步骤5进行了血清中和实验验证，中和蛋白的制备步骤及实验过程同实施例4的步骤4，中和实验所得到的的实验结果如图8和图9；图8为患者1的血清中和实验结果图，其中，C:加PBST中和血清；D:加CAMK2A蛋白中和血清；E:加对照蛋白中和血清；图9为患者2的血清的中和实验，其中，F:加PBST中和血清；G:加CAMK2A蛋白中和血清；H:加对照蛋白中和血清。

由图8和图9可以看出，患者血清中的阳性信号可被含有CAMK2A的封闭蛋白中和，因此，患者1和患者2的血清在过表达CAMK2A的细胞爬片上出现的信号为CAMK2A特异性信号。

实施例6结论：患者1和患者2血清中存在与人CAMK2A抗原相结合的自身抗体。当患者出现了睡眠障碍、嗜睡、抑郁、认知和精神异常、自主神经功能障碍、癫痫发作、意识水平下降及意识模糊这些神经系统症状中的一种或几种时，患者样本中如果检测出CAMK2A自身抗体，即该患者患有自身免疫性脑炎。

实施例7

基于细胞的免疫荧光法验证抗CAMK2A自身抗体的特异性

1、取实施例6已经干燥好的过表达CAMK2A的细胞爬片，备用；

2、选取具有各种神经自身抗体(抗Hu、Yo、CV2、Ma2、Amphiphysin、 Ma1、SOX1、NMDAR、AMPAR1、AMPAR2、LGI1、CASPR2、GABABR、 DPPX、IgLON5、DPPX)的30位患者和40位健康对照的血清，进行免疫荧光染色，具体步骤如下：(1)爬片洗涤：使用PBST洗涤细胞爬片；(2)一抗孵育：按照1:10的比例孵育患者血清，室温孵育1h；(3)洗涤：PBST 洗3次，每次5min；(4)二抗孵育：加入荧光标记的二抗，室温孵育40mi； (5)洗涤：PBST洗3次，每次5min；(6)；显微镜下观察结果。

3、拍照：在表达CAMK2A的HEK293细胞爬片上，上述血清均不产生与患者血清相似的信号。

实施例7结论：患有本发明首次描述的神经系统疾病的患者具有针对 CAMK2A蛋白的自身抗体，而另一些患有神经系统疾病的患者和健康受试者样本没有这种抗体。本发明为实现神经系统疾病的诊断提供了待测的与自身抗体结合的新抗原。

实施例8

CAMK2A突变体检测患者血清中的CAMK2A自身抗体

本实施例选择人CAMK2A基因的一个突变体，即缺失了编码CAMK2A 基因序列的后12个氨基酸的基因，按照实施例6的步骤进行载体构建、制备过表达缺失CAMK2A基因的细胞爬片及对患者血清检测，结果显示，缺失了后12个氨基酸编码的基因并不影响对患者血清中抗体的检测。具体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3：

MATITCTRFTEEYQLFEELGKGAFSVVRRCVKVLAGQEYAAKIINTK KLSARDHQKLEREARICRLLKHPNIVRLHDSISEEGHHYLIFDLVTGGELF EDIVAREYYSEADASHCIQQILEAVLHCHQMGVVHRDLKPENLLLASKLK GAAVKLADFGLAIEVEGEQQAWFGFAGTPGYLSPEVLRKDPYGKPVDLW ACGVILYILLVGYPPFWDEDQHRLYQQIKAGAYDFPSPEWDTVTPEAKDLI NKMLTINPSKRITAAEALKHPWISHRSTVASCMHRQETVDCLKKFNARRK LKGAILTTMLATRNFSGGKSGGNKKSDGVKKRKSSSSVQLMESSESTNTT IEDEDTKVRKQEIIKVTEQLIEAISNGDFESYTKMCDPGMTAFEPEALGNL VEGLDFHRFYFENLWSRNSKPVHTTILNPHIHLMGDESACIAYIRITQYLD AGGIPRTAQSEETRVWHRRDGKWQIVH*

实施例9

抗CAMK2A自身抗体在疑似自身免疫性脑炎患者样本中的检出情况

1、取实施例6已经干燥好的过表达CAMK2A的细胞爬片，备用；

2、选取103例具有脑炎症状，临床怀疑为自免性脑炎的患者样本，107 例疑似周围神经病患者样本，使用实施例6的细胞爬片进行免疫荧光检测；

3、结果：在103例疑似自免性脑炎患者中检出4例抗CAMK2A自身抗体阳性，而107例疑似周围神经病患者的样本抗CAMK2A自身抗体均为阴性；

实施例9结论：抗CAMK2A自身抗体可在脑炎患者中检出，而在周围神经病患者中未检出，说明该抗体对自免性脑炎疾病的诊断具有辅助作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 陕西脉元生物科技有限公司

<120> 抗CAMK2A自身抗体的试剂在制备诊断神经系统症状相关疾病的试剂盒中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 489

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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1 5 10 15

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20 25 30

Val Leu Ala Gly Gln Glu Tyr Ala Ala Lys Ile Ile Asn Thr Lys Lys

35 40 45

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210 215 220

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Gln Leu Met Glu Ser Ser Glu Ser Thr Asn Thr Thr Ile Glu Asp Glu

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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Val Leu Ala Gly Gln Glu Tyr Ala Ala Lys Ile Ile Asn Thr Lys Lys

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145 150 155 160

Ile Glu Val Glu Gly Glu Gln Gln Ala Trp Phe Gly Phe Ala Gly Thr

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Pro Val Asp Leu Trp Ala Cys Gly Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu Val

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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180 185 190

Pro Val Asp Leu Trp Ala Cys Gly Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu Val

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<211> 1470

<212> DNA

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gccaagatca tcaacacaaa gaagctgtca gccagagacc atcagaagct ggagcgtgaa 180

gcccgcatct gccgcctgct gaagcacccc aacatcgtcc gactacatga cagcatctca 240

gaggagggac accactacct gatcttcgac ctggtcactg gtggggaact gtttgaagat 300

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gaggctgtgc tgcactgcca ccagatgggg gtggtgcacc gggacctgaa gcctgagaat 420

ctgttgctgg cctccaagct caagggtgcc gcagtgaagc tggcagactt tggcctggcc 480

atagaggtgg agggggagca gcaggcatgg tttgggtttg cagggactcc tggatatctc 540

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atggctacca tcacctgcac ccgattcacg gaagagtacc agctcttcga ggaactggga 60

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gccaagatta tcaacaccaa gaagctctca gccagagatc accagaagtt ggaacgcgag 180

gcccgcatct gccgcttgtt gaagcacccc aatatcgtcc gactccatga cagcatctcc 240

gaggaggggc accactacct tatcttcgat ctggtcactg gtggggagct gttcgaagac 300

attgtggccc gggagtatta cagtgaggct gatgccagcc actgtatcca gcagatcctg 360

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