同时检测呋喃它酮代谢物、孔雀石绿及隐孔雀石绿的免疫检测方法

摘要

本发明提供了一种同时检测呋喃它酮代谢物（AMOZ）、孔雀石绿（MG）及隐孔雀石绿（LMG）的免疫检测方法。本发明科学合成AMOZ半抗原和LMG半抗原，将其分别与载体蛋白偶联制备人工抗原。利用AMOZ人工抗原和LMG人工抗原，分别制备针对两种对象的杂交瘤细胞株，采用杂交?杂交瘤技术制备分泌同时抗AMOZ和LMG的双特异性抗体，并成功建立多残留免疫检测方法，实现对AMOZ、MG及LMG的同时检测，对AMOZ的检测限为0.1 ng/mL，半抑制浓度为1.3 ng/mL，对LMG的检测限为4.8 ng/mL，半抑制浓度为45.3 ng/mL。本发明方法特异性强，灵敏度较高，操作方法简便，在食品中AMOZ、MG及LMG的多残留检测方面具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域，更具体地，涉及一种同时检测呋喃它 酮代谢物AMOZ、孔雀石绿及隐孔雀石绿的免疫检测方法。

背景技术

呋喃它酮和孔雀石绿是水产品中经常检出的禁用药物。呋喃它酮代谢物 AMOZ(CAS号：43056-63-9)是呋喃它酮在动物体内的代谢产物，能以蛋白结 合物的形式长期稳定存在于动物组织内，可以通过检测代谢产物的手段来分析 呋喃它酮残留。隐孔雀石绿(LMG，CAS号：129-73-7)是孔雀石绿(MG，CAS 号：2437-29-8)在水生动物体内的主要代谢产物，能在动物组织中蓄积，长期 稳定存在。

AMOZ、MG及LMG所造成的危害主要表现在它们所存在的毒性作用，以 及可能对生物体引起的过敏反应和变态反应，潜在的致畸、致癌、致突变作用 等。目前，国内外有很多与AMOZ、MG及LMG免疫检测相关的研究报道，但 这些研究主要集中于单一对象检测。由于环境及食品中组分复杂，单一对象的 免疫分析方法已难以满足实际检测的需要。AMOZ和MG、LMG都是水产品经 常检测的指标。目前国内外暂无AMOZ、MG及LMG的多残留免疫检测方法， 因此，同时针对三者提供一种简便、快速的免疫检测方法是非常有必要并亟需 的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有AMOZ、MG及LMG单残留免疫检测 技术的不足，提供一种可应用于同时检测AMOZ、MG及LMG的AMOZ半抗 原及人工抗原、LMG半抗原及人工抗原和能同时识别AMOZ和LMG的双特异 性抗体。

本发明要解决的另一技术问题是提供一种同时检测AMOZ、MG及LMG的 免疫检测方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种AMOZ半抗原，具有如式(I)所示的结构，记为AMOZMB：

本发明提供了所述AMOZ半抗原AMOZMB的制备方法，包括以下步骤： 将4-巯基苯甲醛和AMOZ分别溶于无水甲醇中，搅拌过程中将AMOZ的甲醇 溶液缓慢滴加到入4-巯基苯甲醛的甲醇溶液中，室温搅拌过夜。反应结束后过 滤，分别用蒸馏水和无水甲醇洗涤，干燥，得产物AMOZMB。

本发明提供了一种AMOZ人工抗原，具有如式(Ⅱ)所示的结构：

本发明提供了上述AMOZ人工抗原的制备方法：AMOZMB作为半抗原与 载体蛋白通过双功能试剂交联法制备得到。所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白、牛 血清白蛋白质或卵清蛋白；所述透析液为生理盐水或0.01mol/LPBS溶液(pH 7.4)。

具体地，所述双功能试剂交联法包括如下步骤：

S11.将载体蛋白溶于PBS溶液中，记为A液；

S12.将双功能试剂溶于N,N-二甲基甲酰胺中，记为B液；

S13.在一定温度下磁力搅拌，将B液逐滴加入A液中，反应一段时间后， 用透析液透析，得溶液C；

S14.将AMOZMB半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺中，将此溶液逐滴加入C 液中，反应一段时间后，用透析液透析，得到人工抗原。

本发明同时提供一种LMG半抗原，具有如式(Ⅲ)所示的结构，记为 LMGMB：

本发明提供了所述LMG半抗原LMGMB的制备方法，包括以下步骤：将 4-巯基苯甲醛溶于无水甲醇中，向其中加入N,N-二甲基苯胺和催化剂BOP(化 学名：六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷)，在氮气保护情况下加热回流， 反应过夜。反应结束后，过滤干燥得产物LMGMB。本发明提供了一种LMG人 工抗原，具有如式(Ⅳ)所示的结构：

本发明提供了LMG人工抗原的制备方法：LMGMB作为半抗原分别与载 体蛋白通过双功能试剂交联法制备得到。所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白、牛血 清白蛋白质或卵清蛋白；所述透析液为生理盐水或0.01mol/LPBS溶液(pH 7.4)。

具体地，所述双功能试剂交联法包括如下步骤：

S21.将载体蛋白溶于PBS溶液中，记为A液；

S22.将双功能试剂溶于N,N-二甲基甲酰胺中，记为B液；

S23.在一定温度下磁力搅拌，将B液逐滴加入A液中，反应一段时间后， 用透析液透析，得溶液C；

S24.将LMGMB半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺中，将此溶液逐滴加入C液 中，反应一段时间后，用透析液透析，得到人工抗原。

本发明还提供了能同时识别AMOZ和LMG的双特异性抗体。

所述同时识别呋喃它酮代谢物(AMOZ)和隐孔雀石绿(LMG)的双特异 性抗体通过以下步骤制备得到：

S31.设计合成AMOZ半抗原和LMG半抗原，并分别将其与载体蛋白偶联， 制备AMOZ人工抗原和LMG人工抗原；

S32.分别利用AMOZ人工抗原和LMG人工抗原免疫动物，制备能分泌抗 AMOZ单克隆抗体的杂交瘤细胞株和抗LMG单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

S33.采用杂交-杂交瘤技术筛选制备抗AMOZ和LMG的双特异性抗体。

其中，S33所述的筛选制备方法，采用杂交-杂交瘤技术，其特征在于首先 对S32所述两种杂交瘤细胞株进行酶缺陷型诱导和筛选，用8-氮鸟嘌呤诱导次 黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷型细胞株，用5-溴尿苷或6-氯嘌 呤诱导胸苷激酶(TK)缺陷型细胞株。然后将经诱导的酶缺陷型细胞株、经S14 或S24所述人工抗原免疫的动物脾细胞按以下组合方式之一进行融合：抗 AMOZ的HGPRT酶缺陷型细胞株+经S24人工抗原免疫的动物脾细胞、抗 AMOZ的TK酶缺陷型细胞株+经S24人工抗原免疫的动物脾细胞、抗LMG的 HGPRT酶缺陷型细胞株+经S14人工抗原免疫的动物脾细胞、抗LMG的TK酶 缺陷型细胞株+经S14人工抗原免疫的动物脾细胞、抗AMOZ的HGPRT酶缺陷 型细胞株+抗LMG的TK酶缺陷型细胞株、抗AMOZ的TK酶缺陷型细胞株+ 抗LMG的HGPRT酶缺陷型细胞株，筛选制备抗AMOZ和LMG的双特异性杂 交瘤细胞株，然后将双特异性杂交瘤经体内诱导或体外培养制备双特异性抗体。

基于上述AMOZ半抗原及人工抗原、LMG半抗原及人工抗原，本发明同 时还提供了一种同时检测AMOZ、MG及LMG的免疫检测方法，包括以下步骤：

S41.分别将AMOZ包被抗原、LMG包被抗原包被在同一酶标板的不同微孔 内，孵育、洗板、封闭；

S42.分别将AMOZ的标准液、LMG标准液或待测样品液加入酶标板相应微 孔内；所述样品液需经还原剂处理，将MG还原为LMG；

S43.将抗AMOZ和LMG的双特异性抗体溶液加入酶标板所有微孔内，孵 育、洗板；

S44.将酶标二抗溶液加入酶标板所有微孔内，孵育、洗板；

S45.将显色液加入酶标板所有微孔内，孵育；

S46.将终止液加入酶标板所有微孔内，并将酶标板用酶标仪读数；

S47.分别绘制AMOZ和LMG的标准曲线，定量检测AMOZ和LMG。

所述还原剂是一定浓度的硼氢化钠、硼氢化钾或硫代硫酸钠溶液，其浓度 为0.1～1mol/L。优选0.2mol/L。

抑制率按下式计算：

其中各标准液浓度孔的吸光值为B，零标准孔的吸光值为B₀。

以各标准品浓度孔吸光值与零标准孔吸光值比值为纵坐标，以药物标准液 浓度的log₁₀值为横坐标，分别绘制标准曲线图。根据建立的标准曲线计算出检 测限LOD(10％抑制率的药物浓度，IC₁₀)和半数抑制量(50％抑制率的药物浓 度，IC₅₀)。

步骤S45所述显色液为步骤S44所述酶标二抗中酶所对应的的底物溶液；

步骤S46所述终止液是一定浓度的浓硫酸或氢氧化钠溶液。所述浓硫酸或 氢氧化钠溶液为1～4mol/L。优选2mol/L。

本发明的有益效果：

本发明的最大创新点是提供了新的AMOZ半抗原及人工抗原、LMG半抗 原及人工抗原，以及能同时识别AMOZ和LMG的双特异性抗体。利用AMOZ 半抗原及人工抗原、LMG半抗原及人工抗原，以及能同时识别AMOZ和LMG 的双特异性抗体，建立了一种同时检测AMOZ、MG及LMG的免疫检测方法， 而现有的传统的免疫检测方法只是利用多克隆抗体、单克隆抗体或基因工程抗 体实现对AMOZ、MG或LMG单一对象的检测。

本发明的有益效果具体体现在：

(1)合成AMOZ半抗原和LMG半抗原，通过将半抗原偶联到载体蛋白上， 成功制备得到两种对象的人工抗原；(2)分别利用AMOZ人工抗原和LMG人 工抗原免疫动物，制备能分泌抗两种对象抗体的杂交瘤细胞；(3)利用药物诱 导和杂交-杂交瘤技术，制备得到能分泌抗AMOZ和LMG的双特异性抗体；(4) 基于一种双特异性抗体，实现对AMOZ、MG及LMG的同时检测；(5)本发 明建立的多残留检测方法具有简便快速、特异性强、灵敏度较高的特点，该方 法对AMOZ检测限为0.1ng/mL，半数抑制浓度为1.3ng/mL，对LMG的检测 限为4.8ng/mL，半抑制浓度为45.3ng/mL。

附图说明

图1为基于双特异性抗体的AMOZ、LMG标准曲线。

图2为半抗原AMOZMB及其人工抗原、载体蛋白紫外扫描图。

图3为半抗原LMGMB及其人工抗原、载体蛋白紫外扫描图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明 做任何形式的限定，本领域技术人员基于本发明所描述的思路和原理所做试剂 的简单替换和用量的改变应属于本发明范围。除非特别说明，本发明实施例所 采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1呋喃它酮代谢物半抗原和隐孔雀石绿半抗原的合成

呋喃它酮代谢物半抗原AMOZMB采用如下所述方法合成：将140mg4-巯 基苯甲醛和225mgAMOZ分别溶于20mL无水甲醇和5mL无水甲醇中，搅拌 过程中将AMOZ的甲醇溶液缓慢滴加到入4-巯基苯甲醛甲醇溶液中，室温搅拌 过夜。反应结束后过滤，分别用蒸馏水和无水甲醇洗涤2次，干燥，得产物 AMOZMB，结构式如下。ESI-MS(negative)m/z：320(M-H)^-，¹H-NMR(500 MHz,d-Chloroform)δ7.90(s,1H),7.50–7.40(m,2H),7.37–7.27(m,2H),5.41 (p,J＝13.9Hz,1H),4.80(dd,J＝24.8,13.6Hz,1H),4.56(dd,J＝24.7,13.7Hz, 1H),3.56(t,J＝9.4Hz,4H),3.21(s,1H),2.93(dd,J＝24.8,14.0Hz,1H),2.81– 2.63(m,5H)。

隐孔雀石绿半抗原LMGMB采用如下所述方法合成：将150mg4-巯基苯甲 醛溶于40mL无水甲醇溶液，向其中加入270mgN,N-二甲基苯胺和催化剂120 mgBOP(化学名：六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷)，在氮气保护情况 下加热回流，80℃反应过夜。反应结束后，过滤干燥得产物LMGMB，结构式 如下。ESI-MS(positive)m/z：363(M+H)⁺，¹H-NMR(500MHz,d-Chloroform) δ7.40–7.30(m,2H),7.13–7.01(m,6H),6.72–6.62(m,4H),5.41(s,1H),3.17(s, 1H),3.02(s,12H)。

实施例2呋喃它酮代谢物人工抗原和隐孔雀石绿人工抗原的制备

AMOZ人工抗原和LMG人工抗原均采用双功能试剂交联法制备，所述双 功能试剂交联法包括如下步骤：

(1)将1/80mmol的BSA或1/60mmol的OVA溶于2mL的0.01mol/LPBS 溶液中，记为A液；

(2)将1/40mmol双功能试剂SMCC(琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基] 环己烷-1-羧化物)溶于0.2mLN,N-二甲基甲酰胺中，记为B液；

(3)在磁力搅拌下，将B液逐滴加入A液中，4℃反应过夜，用0.01mol/L PBS溶液(pH7.4)透析2天，每天更换两次透析液，得溶液C。

(4)将1mmol半抗原AMOZMB(或半抗原LMGMB)溶于0.2mLN,N- 二甲基甲酰胺中，将此溶液逐滴加入C液中。4℃反应过夜，用0.01mol/LPBS 溶液(pH7.4)透析3天，每天更换2次透析液，得到人工抗原AMOZMB-BSA 和AMOZMB-OVA(LMGMB-BSA和LMGMB-OVA)。将所得各人工抗原分装 成小管，-20℃保存。

AMOZ人工抗原结构式如(Ⅱ)所示：

LMG人工抗原结构式如(Ⅳ)所示：

实施例3呋喃它酮代谢物单克隆抗体、隐孔雀石绿单克隆抗体的制备

分别用实施例2制备得到的人工抗原AMOZMB-BSA和LMGMB-BSA免疫 雌性Balb/c小鼠。首次免疫时，取0.5μg的AMOZMB-BSA人工抗原或 LMGMB-BSA人工抗原与等体积弗氏完全佐剂乳化，采用皮下多点免疫。

首次免疫后，进行多次的加强免疫，步骤如下：取0.5μg的上述人工抗原 与等量的弗氏不完全佐剂乳化，间隔周期为2周。每次加强免疫1周后，尾部 取血测定抗血清效价。待效价稳定不变时，选取免疫效果最好的小鼠加强一次 免疫，3天后取脾细胞进行细胞融合，制备单克隆抗体。

分别采用以下方法制备能分泌抗AMOZ单克隆抗体的杂交瘤细胞株和分泌 抗LMG单克隆抗体的杂交瘤细胞株：将购买于中国科学院上海细胞库的SP2/0 骨髓瘤细胞与脾细胞以1：5～1：10的比例混合，在聚乙二醇(PEG2000)的 作用下融合，将融合的细胞悬浮后铺于含饲养层细胞的HAT培养基(终浓度为 80％RPMI1640基础培养基(Hyclone)、20％胎牛血清(Hyclone)、1％HAT (Sigma))的96孔板中，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。融合后，待细 胞集落长满孔底的1/4时，取上清液采用间接竞争ELISA法筛选分泌抗AMOZ 或LMG抗体的细胞孔，选取阳性值最高，而且竞争抑制较为明显的单克隆细胞 孔的细胞，用有限稀释的方法进行克隆化、扩大培养，得到稳定分泌抗AMOZ 或LMG抗体的杂交瘤细胞株。

实施例4呋喃它酮代谢物和隐孔雀石绿双特异性抗体的制备

使用8-氮鸟嘌呤(8-AG)对实施例2中制备的分泌抗AMOZ抗体的杂交瘤 细胞株进行酶缺陷型诱导，将该细胞株置于含不同浓度(25、50、100μg/mL) 的8-AG的完全培养基(终浓度为80％RPMI1640基础培养基(Hyclone)、20％ 胎牛血清(Hyclone))，每个浓度培养2周，得到胸苷激酶(TK)缺陷型的细胞 株。

使用5-溴尿苷(5-BrdU)对实施例2中制备的分泌抗LMG抗体的杂交瘤细 胞株进行酶缺陷型诱导，将该细胞株置于含不同浓度(5、10、20、40μg/mL) 的8-AG的完全培养基(终浓度为80％RPMI1640基础培养基(Hyclone)、20％ 胎牛血清(Hyclone))，每个浓度培养2周，得到次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶(HGPRT)缺陷型的细胞株。

将TK缺陷型的AMOZ细胞株与HGPRT缺陷型的LMG细胞株以1：1的 比例混合，在聚乙二醇(PEG2000)的作用下融合，将融合的细胞悬浮后铺于 含饲养层细胞的HAT培养基(终浓度为80％RPMI1640基础培养基(Hyclone)、 20％胎牛血清(Hyclone)、1％HAT(Sigma))的96孔板中，置于37℃、5％ CO₂的培养箱中培养。融合后，待细胞集落长满孔底的1/4时，取上清液采分别 使用人工抗原LMGMB-OVA和AMOZMB-OVA用间接竞争ELISA法筛选分泌 抗AMOZ或LMG抗体的细胞孔，选取阳性值最高，而且竞争抑制较为明显的 单克隆细胞孔的细胞，用有限稀释的方法进行克隆化、扩大培养，得到稳定分 泌抗AMOZ和LMG的双特异性抗体的杂交-杂交瘤细胞株。

将0.5mL液状石蜡注射到Balb/C小鼠腹腔，1～2周后向腹腔注射1～2×10⁶个四体杂交瘤细胞，每只小鼠0.5mL，接种大约10天左右可见小鼠腹部肿胀， 在小鼠死亡之前处死小鼠，采集腹水，12000r/min离心15min，去除上层脂肪 和下层纤维蛋白及细胞，将中层微黄色液体分装，保存于-20℃备用。双特异性 抗体采用常规辛酸-硫酸铵法纯化。

实施例5ELISA法同时检测呋喃它酮代谢物、孔雀石绿及隐孔雀石绿

(1)分别将500ng/mLAMOZMB-OVA、250ng/mLLMGMB-OVA包被在 同一ELISA酶标板的不同微孔内，经37℃包被过夜后，每孔加入120μL5％脱 脂奶粉溶液于37℃封闭3h。甩干孔内液体后，37℃烘1h，备用；

(2)向样品处理液加入1mL0.2mol/L的硼氢化钾溶液，混匀后阴暗处静 置10min，得到经还原的样品液；

(3)将50μL一系列浓度(0、0.049、0.245、1.225、6.125、30.625、153.127、 765.634ng/mL)AMOZ标准液或经还原的样品液加入AMOZMB-OVA包被的微 孔内；将50μL一系列一定浓度(0、2.74、8.23、24.69、74.07、222.22、666.67、 2000ng/mL)LMG标准液或经还原的样品液加入LMGMB-OVA包被的微孔内；

(4)各孔加入50μL1：10000稀释的抗AMOZ和LMG的双特异性抗体， 37℃孵育30min，倒出孔内液体，用洗涤液洗涤5次，在吸水纸上拍干；

(5)各孔加入100μL1：5000稀释的酶标二抗溶液，37℃温育30min， 用洗涤液洗涤5次，拍干；

(6)各孔加入100μLTMB底物显色溶液，37℃温育10min，加入50μL 的2mol/L硫酸溶液终止，用酶标仪在波长450nm处测定吸光值，以各标准品 浓度孔吸光值与零标准孔吸光值比值为纵坐标，以药物标准液浓度的log₁₀值为 横坐标，绘制标准曲线图。

抑制率按下式计算：

其中各标准液浓度孔的吸光值为B，零标准孔的吸光值为B₀。

根据建立的标准曲线计算出检测限LOD(10％抑制率的药物浓度，IC₁₀)和 半数抑制量(50％抑制率的药物浓度，IC₅₀)。

(7)将AMOZ的几种类似物进行梯度稀释，然后与双特异性抗体进行反 应，制作标准曲线。通过曲线分别计算出各类似物的IC₅₀，计算建立的多残留 检测方法对AMOZ类似物的交叉反应率：

将LMG的几种类似物进行梯度稀释，然后与上述双特异性抗体进行反应， 制作标准曲线。通过曲线分别计算出各类似物的IC₅₀，计算建立的多残留检测 方法对LMG类似物的交叉反应率：

结果表明，本发明建立的多残留检测方法对AMOZ为1.3ng/mL，检测限为 0.1ng/mL，在0.3～6.4ng/mL的范围内，抑制率与AMOZ浓度的对数值成显著 的S型曲线关系，相关系数为0.9940。对LMG的半数抑制量(IC₅₀)为45.3 ng/mL，检测限为4.8ng/mL，在7.0～291.7ng/mL的范围内，抑制率与LMG浓 度的对数值成显著的S型曲线关系，相关系数为0.9998。采用本发明方法对 MG的检测可通过将MG还原为LMG，然后根据LMG的标准曲线进行检测。 所以MG的检测标准曲线参照LMG标准曲线。

本发明建立的多残留检测方法对AMOZ和LMG检测的特异性强，见表1、 表2所示，可以很好地用来作为食品中AMOZ、MG及LMG的同时多残留免疫 分析方法。

表1本发明建立的检测方法对AMOZ类似物的交叉反应率

表2本发明建立的检测方法对LMG类似物的交叉反应率