部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针及其制备方法

摘要

本发明公开一种部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针及其制备方法，其是通过氧化石墨烯在碱性溶液中的室温控制还原制备部分还原氧化石墨烯。本发明制备方法具有绿色环保，操作简便快捷，重现性好等优点。所制备的部分还原的氧化石墨烯纳米探针具有较大的sp2杂化区域，较少的表面缺陷及良好的分散性和稳定性。所制备的部分还原氧化石墨烯对荧光分子修饰单链DNA的荧光猝灭效率和猝灭速度均大幅度提高，是一种较为理想的荧光共振能量转移纳米探针。

说明书

技术领域

本发明涉及部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针及其制备方法，属于 纳米技术领域。

背景技术

石墨烯（graphene）是紧密堆积成二维蜂窝状晶格结构的杂化单层碳原子晶体，厚 度仅0.335nm，是目前世上最薄却也是最坚硬的纳米材料。石墨经过氧化剥离而得的衍生 物-氧化石墨烯（grapheneoxide,GO），其表面有大量的羟基、羧基、羰基等含氧基团，这些 官能团的存在使得氧化石墨烯具有极好的亲水性，能在水溶液体系中形成稳定的胶束溶 液，同时具有良好的化学可修饰性，常被用作生物传感研究中识别元件的载体。

荧光共振能量转移是能量由供体荧光团经无辐射途径转移给受体荧光团，并引起 供体荧光猝灭和受体荧光增强的光学现象。近年来，人们致力于开发基于氧化石墨烯荧光 淬灭效应的荧光共振能量转移传感器，并将其用于生物及化学检测。研究表明，氧化石墨烯 与单链DNA（ssDNA）具有较强的吸附作用而对双链DNA（dsDNA）的吸附能力较弱。荧光分子修 饰的ssDNA可吸附在氧化石墨烯表面，通过荧光共振能量转移引起荧光淬灭。若荧光分子修 饰的ssDNA与其互补链杂交形成双链后则不能被氧化石墨烯吸附，从而保持荧光特性。与其 它有机猝灭剂相比，氧化石墨烯不仅有较高的猝灭效率、信噪比，而且拥有纳米材料所特有 的优点，可保护其表面修饰的生物分子稳定性，阻止酶切，在DNA、RNA、蛋白质、重金属离子 及小分子物质的检测方面具有广阔的应用前景。

本发明提供了一种部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针及其制备的 新方法。部分还原氧化石墨烯通过氧化石墨烯在碱性溶液中的室温控制还原得到，在保持 水溶液体系稳定性的基础上，有效增加了sp²杂化晶域，对荧光分子修饰ssDNA的荧光猝灭 效率和猝灭速度均大幅度提高，是一种理想的荧光共振能量转移纳米探针。

发明内容

本发明的目的是提供一种部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针及制 备方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种部分还原氧化石墨烯荧光共 振能量转移纳米探针，其特征是片层厚度为1.1nm，2?(001)为10.86°~11.10°，2? (002)为22.10°~22.66°，C/O比值为0.49~0.53，碳碳键比例为34.22%~52.46%，能猝灭荧光 分子修饰单链DNA的荧光。

所述荧光猝灭效应随着碳碳键比例的增加而增强。

在15μL浓度为100μg/mL的部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针，加 入40μL浓度为500nmol/L的6-羧基荧光素修饰ssDNA和445μL10mmol/L、pH8.0的含50 mmol/LNaCl和1mmol/LEDTA的Tris-HCl缓冲液，室温反应30秒，荧光猝灭率为44.5~ 99.3%。

本发明所述的一种部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针的制备方法， 其特征是将氧化石墨烯水溶液与NaOH水溶液等体积混合，室温反应后，离心水洗，沉淀恒温 干燥，得到部分还原氧化石墨烯固体，将部分还原氧化石墨烯固体加水超声剥离得稳定的 部分还原氧化石墨烯水溶液。

上述所使用的氧化石墨烯制备方法为：将鳞片石墨加入到浓硫酸和磷酸的混合溶 液中，充分搅拌后，置于在0℃冰浴中，将高锰酸钾少量多次，缓慢加入到以上混合溶液中， 保持0℃冰浴，磁力搅拌后，将所得墨绿混悬液转移到温水浴中获得墨绿混悬液，然后将所 得墨绿混悬液转移至温水浴中，反应获得紫黑色混悬液，将冰水缓慢加入到得到的紫黑色 混悬液中，剧烈搅拌获得溶液，继而往溶液中逐滴滴加过氧化氢溶液，溶液颜色突变为亮黄 色，搅拌后所得溶液经孔径20-30微米的G1砂芯漏斗过滤，继而离心分离，弃去上清液；沉淀 物中加入双蒸水充分振荡洗涤，离心分离，弃去上清液，沉淀颜色呈土黄色；再加入盐酸充 分振荡洗涤，经孔径20-30微米的G1砂芯漏斗过滤去除不溶颗粒，滤液离心分离，弃去上清 液，沉淀颜色继续加深；接着用无水乙醇将沉淀物洗至pH值为中性，离心分离，弃去上清液， 沉淀呈棕黄色；最后用乙醚冲洗沉淀，经孔径1.5-2.5微米的G5砂芯漏斗过滤，滤饼在室温 下过夜晾干，得到棕色的氧化石墨烯。

所述NaOH水溶液的浓度为20mmol/L~10mmol/L。

所述反应时间为0.5~2小时。

所述恒温干燥温度为50~60℃，干燥时间为6~12小时。

上述所使用的氧化石墨烯制备方法为：称取325目鳞片石墨2.7g，加入到316mL 浓度为18.4mol/L的浓硫酸和36mL浓度为14.7mol/L的磷酸的混合溶液中，充分搅拌后， 置于在0℃冰浴中，将16.2g高锰酸钾少量多次，缓慢加入到以上混合溶液中，保持0℃冰 浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿混悬液转移至35℃温水浴中，控温1小时，然后将所得墨 绿混悬液转移至50℃温水浴中，控温12小时，360mL冰水缓慢加入到得到的紫黑色混悬液 混合物中，剧烈搅拌1小时，继而往溶液中逐滴滴加12mL30wt%过氧化氢溶液，溶液颜色 突变为亮黄色，搅拌30分钟，所得溶液经孔径20-30微米的G1砂芯漏斗过滤，继而4000转 每分钟离心30分钟，弃去上清液；加入180mL双蒸水充分振荡洗涤，4000转每分钟离心30 分钟，弃去上清液，沉淀颜色呈土黄色；再加入180mL30wt%盐酸充分振荡洗涤，经孔径20- 30微米的G1砂芯漏斗过滤去除不溶颗粒，滤液4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉 淀颜色继续加深；接着多次用无水乙醇将沉淀物洗至pH值为中性，4000转每分钟离心30分 钟，弃去上清液，沉淀呈棕黄色；最后用乙醚冲洗沉淀，经孔径1.5-2.5微米的G5砂芯漏斗过 滤，滤饼在室温下过夜晾干，得到棕色的氧化石墨烯。

本发明的具体技术方案为：

（一）氧化石墨烯的制备

称取325目鳞片石墨，加入到体积比为9:1的浓硫酸和磷酸混合溶液中。充分搅拌后，置 于在0℃冰浴中。将高锰酸钾少量多次，缓慢加入到以上混合溶液中。保持0℃冰浴，磁力 搅拌3小时后，将所得墨绿混悬液转移至35℃温水浴中，控温1小时，然后再将混悬液转移 至50℃温水浴中，控温12小时。将一定量的冰水混合物缓慢加入到得到的紫黑色混悬液 中，剧烈搅拌1小时。继而往溶液中逐滴滴加30%过氧化氢溶液，至溶液颜色突变为亮黄色。 所得溶液经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤，继而4000转/分钟离心30分钟，分别经过水 洗一次，酸洗一次，醇洗至中性，最后用乙醚冲洗后经G5砂芯漏斗（孔径1.5-2.5微米）过滤。 滤饼在室温下过夜晾干，得到氧化石墨。

（二）部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针的制备

将4mg/mL上述方法制备的氧化石墨烯水溶液分别与20mmol/L，2mmol/L和10mmol/ L的NaOH水溶液等体积混合，室温条件下搅拌反应2小时，12000转/分钟离心30分钟，并用 水洗涤至中性。最后置于恒温干燥箱50℃干燥12小时，即可得到不同还原程度的部分还原 氧化石墨烯固体（以pRGO₁，pRGO₂和pRGO₃表示三种不同还原程度的部分还原氧化石墨烯固 体）。

本发明的优点：

（1）本发明在温和的化学反应条件下合成部分还原氧化石墨烯。制备方法绿色环保，操 作简便快捷，重现性好。

（2）本发明所制备的部分还原的氧化石墨烯具有较大的sp²杂化区域，较少的表面 缺陷及良好的分散性和稳定性。

（3）本发明所制备的部分还原的氧化石墨烯可作为高效荧光共振能量转移纳米探 针。

附图说明

图1为GO、pRGO₁、pRGO₂和pRGO₃水溶液的外观图。

图2为GO和pRGO₃的原子力显微镜图，图中：a为GO，b为pRGO₃，c为GO的片层厚度曲 线，d为pRGO₃的片层厚度曲线。

图3为GO、pRGO₁、pRGO₂和pRGO₃的X射线衍射图。

图4为GO、pRGO₁、pRGO₂和pRGO₃的拉曼光谱图。

图5为GO、pRGO₁、pRGO₂和pRGO₃的X光射线电子能谱的比较图，图中：A为GO，B为 pRGO₁,C为pRGO₂,D为pRGO₃。

图6为GO、pRGO₁、pRGO₂、pRGO₃分别与6-羧基荧光素修饰的ssDNA室温反应30秒后的 荧光光谱（激发波长494nm）。

图7为荧光猝灭率与碳碳键比例的关系图。

具体实施方式

实例1：

称取325目鳞片石墨2.7g，加入到316mL浓度为18.4mol/L的浓硫酸和36mL浓度为 14.7mol/L的磷酸的混合溶液中。充分搅拌后，置于在0℃冰浴中。将16.2g高锰酸钾少量 多次，缓慢加入到以上混合溶液中。保持0℃冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿混悬液转 移至35℃温水浴中，控温1小时，然后将所得墨绿混悬液转移至50℃温水浴中，控温12小 时。360mL冰水缓慢加入到得到的紫黑色混悬液中，剧烈搅拌1小时。继而往溶液中逐滴滴 加12mL30wt%过氧化氢溶液，溶液颜色突变为亮黄色，搅拌30分钟。所得溶液经G1砂芯 漏斗（孔径20-30微米）过滤，继而4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液；加入180mL双 蒸水充分振荡洗涤，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色呈土黄色；再加入 180mL30wt%盐酸充分振荡洗涤，经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤去除不溶颗粒，滤 液4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色继续加深；接着多次用无水乙醇将沉 淀物洗至pH值为中性，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀呈棕黄色；最后用乙醚 冲洗沉淀，经G5砂芯漏斗（孔径1.5-2.5微米）过滤。滤饼在室温下过夜晾干，得到棕色的氧 化石墨烯。取400mg氧化石墨溶解于100mL双蒸水，常温下超声3小时，充分剥离后得到4 mg/mL透明澄清的棕黄色氧化石墨烯水溶液。

实例2

取10mg实施例1所制备的氧化石墨溶解于100mL双蒸水，常温下超声3小时，充分剥离 后得到0.1mg/mL透明澄清的棕黄色氧化石墨烯水溶液（图1）。

实例3

将4mg/mL实施例1所制备的GO水溶液与20μmol/LNaOH水溶液等体积混合，在室温条 件下搅拌反应2小时，12000转/分钟离心30分钟，沉淀用水洗涤至中性，50℃干燥12小时 得到部分还原的氧化石墨1（pRGO₁）。取10mgpRGO₁溶解于100mL双蒸水，常温下超声5小 时，充分剥离后得到0.1mg/mL透明澄清的棕色pRGO₁水溶液（图1）。

实例4

将4mg/mL实施例1所制备的GO水溶液与2mmol/LNaOH水溶液等体积混合，在室温条 件下搅拌反应2小时，12000转/分钟离心30分钟，沉淀用水洗涤至中性，50℃干燥12小时 得到部分还原的氧化石墨2（pRGO₂）。取10mgpRGO₂溶解于100mL双蒸水，常温下超声5小 时，充分剥离后得到0.1mg/mL透明澄清的棕色pRGO₂水溶液（图1）。

实例5：

将4mg/mL实施例1所制备的GO水溶液与10mmol/LNaOH水溶液等体积混合，在室温条 件下搅拌反应2小时，12000转/分钟离心30分钟，沉淀用水洗涤至中性，50℃干燥12小时 得到部分还原的氧化石墨3（pRGO₃）。取10mgpRGO₁溶解于100mL双蒸水，常温下超声5小 时，充分剥离后得到0.1mg/mL透明澄清的棕色pRGO₁水溶液（图1）。

实例6：

分别取10mL3mg/mLGO水溶液和10mL3mg/mLpRGO₃水溶液滴于云母片上，过夜 自然干燥，用原子力显微镜观察其尺寸大小及片层厚度。如图2所示，GO（图2中的a）和 pRGO₃（图2中的b）的尺寸基本一致，图2中c为GO的片层厚度曲线，d为pRGO₃的片层厚度曲线， 由结果可知GO和pRGO₃的片层厚度均为1.1nm。

实例7：

将制得的GO，pRGO₁，pRGO₂和pRGO₃进行粉末X射线衍射测定。如图3所示，GO，pRGO₁， pRGO₂和pRGO₃测得的2?(001)为9.64°，10.86°，10.98°，和11.10°，2?(002)分别为 18.90°，22.10°，22.58°和22.66°。

实例8：

将制得的GO，pRGO₁，pRGO₂和pRGO₃进行拉曼光谱测定。测得I_D/I_G分别为0.93，0.89， 0.90，0.86（图4）。其比值总体情况有所降低说明还原过程使氧化石墨烯部分缺陷被修复， 有序原子排列区域增加。

实例9：

将制得的GO，pRGO₁，pRGO₂和pRGO₃进行X射线光电子能谱测定。由图5可知，随着还原 程度的增强，氧化石墨烯表面的含氧官能团逐渐减少，而Csp²杂化区域逐渐增多，C/O比值 由0.46分别增加为0.49，0.51和0.53，碳碳键比例由21.47%分别增加为34.22%,43.92%, 和52.46%。

实例10：

分别取15μL100μg/mLGO、pRGO₁、pRGO₂、pRGO₃，加入40μL500nmol/L6-羧基荧光 素修饰的ssDNA和445μL10mmol/LpH8.0的Tris-HCl缓冲液（含50mmol/LNaCl和1 mmol/LEDTA），室温反应30秒，分别测定荧光光谱（激发波长494nm）。由图6、7可知，部分还 原氧化石墨烯的荧光猝灭效应（荧光猝灭率为44.5~99.3%）强于氧化石墨烯（荧光猝灭率为 28.4%），且随着碳碳键比例的增加荧光猝灭增强。

以上所述仅为本发明的典型实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。