鸡胚活性肽在制备保护细胞活力的产品中的应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鸡胚活性肽及其制备方法与应用。本发明提供的鸡胚活性肽，包括鸡胚活性肽和游离氨基酸；其中，鸡胚活性肽的分子量小于10kDa。本发明提供的鸡胚活性肽能够保护人成纤维细胞的活性，与不添加本发明鸡胚活性肽的对照组相比，添加鸡胚活性肽的实验组人成纤维细胞的活性得到保护。与不进行紫外照射的空白组相比，实验组的人成纤维细胞活性与之持平甚至略有升高。本发明提供的鸡胚活性肽的制备方法操作简便，通过匀浆、冻融和超声破碎，最大程度上的破碎了细胞膜，使胞内的活性肽得到良好的溶出，再经离心和超滤等生物技术提取工艺，从而提高了提取效率。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及鸡胚活性肽在制备保护细胞活力的产品中的应用。

背景技术

皮肤作为人体最大的器官覆盖全身，是身体的保护层，对人体起着极其重要的作用。而面部皮肤不仅能够抵御外界细菌侵入身体，也是衡量一个人健康貌美的标准。常见的面部皮肤问题有：细纹、红血丝、瘢痕、肤色暗沉等。造成这些皮肤问题的主要原因是：面部皮肤长年累月的暴露在空气中，紫外线的照射，空气中漂浮着的污物、尘埃、细菌自然的有害物质刺激皮肤表面。加上自身分泌的油脂、汗液、死细胞等，这些因素会影响皮肤正常功能的发挥，造成面部皮肤细胞的活力下降甚至死亡，从而导致一系列的皮肤问题。

鸡胚即鸡的胚胎，是受精鸡蛋孵化至一定天数后，还未破壳可食用完整的生命体。研究表明，鸡胚中包含的营养成分包括蛋白质、多肽、氨基酸、碳水化合物(葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、呋喃糖等)、脂类、脂肪酸等。另外，鸡胚中还包括抗感染成分和生物活性物质。所述的抗感染成分有球蛋白、干扰素、胎儿蛋白、溶菌酶和磷酸二酯酶；所述的生物活性物质有唾液酸、儿苯酚胺、胰岛素样生长因子-I、胰岛素、激肽酶、组胺酶、胆碱、红细胞生成素、脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶等。相对于未孵化的鸡蛋，鸡胚中营养成分，特别是小分子蛋白或多肽的含量更加丰富，而脂肪、胆固醇等含量则大幅下降。

鸡胚营养丰富，具有潜在的护肤抗衰、消火抗过敏、保健和药用价值。但目前对鸡胚中肽的研究目前还较少，应对其进行在化妆品、保健品消火抗过敏的研究中进一步的开发和利用。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供鸡胚活性肽在制备保护细胞活力的产品中的应用。本发明实验证明，鸡胚活性肽能够促进细胞的生长，维持细胞的活性。

本发明提供了鸡胚活性肽在制备保护细胞活力的产品中的应用。

在本发明的实施例中，细胞为人成纤维细胞。

在本发明的实施例中，鸡胚活性肽保护细胞活力保护的剂量为250μg/mL～500μg/mL。

在本发明实施例中，鸡胚活性肽保护细胞活力保护的剂量为250μg/mL。

本发明还提供，鸡胚活性肽在制备的化妆品中的应用；化妆品为具有修复红血丝、美白、祛皱、活肤细胞复苏修复或去瘢痕的功能的化妆品。

一种化妆品，包括鸡胚活性肽、透明质酸、黄原胶、荷荷巴油、熊果苷和甘油。

其中，鸡胚活性肽的浓度为0.5mg/mL～3.0mg/mL，透明质酸的质量分数为0.3％，黄原胶质量分数0.3％，荷荷巴油质量分数1％，熊果苷质量分数0.5％，甘油的质量分数为3％，余量为去离子水。

人成纤维细胞是普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞，位于真皮层。能够分泌胶原、纤连蛋白和胶原酶等细胞外基质成分。促进成纤维细胞的活性能够使皮肤恢复弹性、改善细纹、红血丝、瘢痕、肤色暗沉等问题。

本发明经试验证实，本发明提供的鸡胚活性肽能够保护人成纤维细胞的活性，与不添加本发明鸡胚活性肽的对照组相比，添加鸡胚活性肽的实验组成纤维细胞的活性得到保护。因此，鸡胚活性肽能够作为改善细纹、肤色暗沉，去除红血丝、瘢痕的化妆品。

本发明制得的鸡胚活性肽中，共检测到活性肽300条，分别来自69种不同的蛋白质。根据PSMs(Peptide-SpectralMatch)，这些蛋白质主要为：Ovalbumin(登录号P01012)、ApolipoproteinB(登录号Q197X2)、Ovotransferrin(登录号E1BQC2)、HistoneH3.2(登录号P84229)、Apovitellenin-1(登录号P02659)、OvoglobulinG2typeAB(登录号I0J174)、OvoglobulinG2(登录号I0J170)、Vitellogenin-2(登录号P02845)、Alpha-1-acidglycoprotein(登录号A7UEB0)和HistoneH4(登录号P62801)。

本发明的鸡胚活性肽中，鸡胚活性肽的浓度为0.1g/μL。

本发明提取得到的鸡胚活性肽中包括18种游离氨基酸，其中包括7种必需氨基酸，分别为苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和色氨酸。另外还包括11种非必需氨基酸，分别为天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸、胱氨酸和脯氨酸。

本发明的鸡胚活性肽中，游离氨基酸的浓度为14.3mg/mL。

本发明提供的鸡胚活性肽的制备方法包括：将鸡胚去壳、匀浆后，破碎细胞；经胰酶酶解后，离心收集上清液，超滤截留分子量小于10kDa的组分。

本发明所采用的鸡胚为孵化至14～19天的鸡胚。

具体的，鸡胚的获取方式为，取SPF级受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化，孵化温度控制在37.5℃，相对湿度60％，每2小时自动翻蛋一次，待孵化至14～19天，

作为优选，采用孵化至16～17天的鸡胚。

受精鸡胚孵化至14天～19天的鸡胚的胚胎处于干细胞高度增长期，各种器官基本形成。在鸡胚的孵化过程中，蛋白质的代谢十分剧烈，孵化期间，蛋白质和多肽的含量呈持续上升状态。研究表明，在孵化的第14天～19天，鸡胚中蛋白质和多肽的增加幅度最大，游离氨基酸的含量也在此期间达到最高。

制备鸡胚多肽前，孵化鸡胚停止孵化。具体为，将孵化鸡胚放置于-20℃停止孵化。

本发明中，所述匀浆采用组织匀浆机。

具体为：将孵化至14d～19d的鸡蛋表面消毒，去除蛋壳后以组织匀浆机匀浆。作为优选，匀浆的温度为4℃，时间为20min转速为2500r/min。

经组织匀浆，鸡胚组织粉碎，细胞在匀浆机的机械作用下初步破碎。为了进一步破碎细胞，进行冻融和超声破碎。

在本发明实施例中，破碎细胞包括冻融和超声破碎的步骤；

冻融的冷冻温度为-20℃～-40℃，时间为60h～80h；溶解温度为4℃～8℃；

超声破碎的温度为4℃～8℃，功率为800W～1200W，时间为15min～25min。

在一些实施例中，破碎细胞包括冻融和超声破碎的步骤；

冻融的冷冻温度为-30℃，时间为72h；溶解温度为4℃；

超声破碎的温度为4℃，功率为1000W，时间为20min。

冻融使细胞在冷冻-融化的过程中，由于细胞内形成冰粒而使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞破碎。本发明中，溶解的温度为4℃，溶解至细胞匀浆融化。经冻融后，细胞膜进一步的破裂，再进行超声波破碎，从而使细胞膜的破碎程度更加完全，提高了活性肽的提取效率。

在本发明中，经过超声破碎的组织匀浆与等体积的水混合后，进行酶解。

所述酶解指在组织匀浆与胰酶共同孵育，使蛋白质发生分解的过程。

本发明中，酶解时胰酶的质量分数为2.5％。即将胰酶加入组织匀浆至质量分数为2.5％。

在本发明中，胰酶的酶活力为37000u/g。

在本发明中，酶解的温度为45℃～55℃，pH值为7.3～7.7，酶解时间为40min～80min。

在一些实施例中，酶解的温度为50℃，pH值为7.5，酶解时间为1h。

离心后，弃除组织碎片，收集上清液。该上清液中富含蛋白质、活性肽和游离氨基酸。

在本发明的实施例中，离心的转速为4500r/min，离心的时间为20min，离心的温度为4℃。

超滤截留具体指使上清液经过10kDa的滤膜，收集10kDa以内的超滤液。

本领域技术人员还可以按照公知的方法对组织匀浆、上清液以及超滤收集的组分进行冷冻干燥。

作为优选，截留后还包括调节pH值为6.8～7.2的步骤。

在pH值为6.8～7.2的范围内，鸡胚活性肽的性质稳定，活性较高。

所述冷冻干燥为鸡胚活性肽与冷冻干燥剂混合，经冷冻干燥制得冻干粉。所述冷冻干燥赋型剂为甘露醇。具体的，组织匀浆、上清液以及超滤收集的组分中加入甘露醇至质量分数为8％进行冷冻干燥。优选的，在超滤收集的组分中加入甘露醇至质量分数为8％进行冷冻干燥。

本发明提供了鸡胚活性肽在制备保护细胞活力的产品中的应用。本发明所采用的鸡胚活性肽中包括鸡胚活性肽和游离氨基酸；其中，鸡胚活性肽的分子量小于10kDa。本发明实验证实，鸡胚活性肽能够保护人成纤维细胞的活性，与不添加本发明鸡胚活性肽的对照组相比，添加鸡胚活性肽的实验组人成纤维细胞的活性得到保护。因此，鸡胚活性肽能够作为改善细纹、肤色暗沉，去除红血丝、美白、祛皱、活肤细胞复苏修复或去瘢痕的功能的化妆品。

附图说明

图1示实施例1制得鸡胚活性肽对人成纤维细胞的保护作用。

具体实施方式

本发明提供了提供鸡胚活性肽在制备保护细胞活力的产品中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的材料、仪器或试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

(1)孵化鸡胚：取SPF级受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化，孵化温度控制在37.5℃，相对湿度60％，每2小时自动翻蛋一次，待孵化至16天，取出受精鸡蛋，放-20℃的冷库中，停止孵化并保存备用。

(2)匀浆及细胞破碎：对孵化的鸡蛋进行表面消毒，去除蛋壳取出鸡胚，在4℃下将鸡胚用组织匀浆机匀浆后，倒入灭菌后的密封盒中，放到-30℃的冷库中冷冻72小时，融解后于4℃的环境中对其进行细胞超声破碎，加入等量的注射用水，放置于4℃的冷藏库中备用。

(3)酶水解及离心：取细胞破碎后的冷藏液加热水浴至50℃,调pH至7.5，加入胰酶至浓度为2.5％(质量分数)水解恒温水浴1小时，在4℃、4500r/min条件下离心20分钟，收上清液在降温至4℃冷藏备用。

(4)超滤及调PH值：将鸡胚浆液超滤过10kDa的滤膜，收集10kDa以内的超滤液，调pH值至6.8～7.2，制得鸡胚活性肽。

活性肽经shotgun分析，活性肽的含量为0.1μg/μL；肽段数量共计300条，分别来自70种不同的蛋白，具体结果如表1：

表1shotgun分析结果

采用GB/T5009.124-2003提供的方法，利用L-8800型氨基酸自动分析仪，对鸡胚活性肽中游离氨基酸进行检测。结果为：

表2游离氨基酸检测

实施例2

利用MTT比色法测定细胞存活率。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在550nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与活细胞数成正比。

MTT法测定细胞活力：

将人成纤维细胞(HDF细胞)(第六代)以1×10⁴个/孔接种于96孔板中；

实验分为实验组、空白对照组；

24小时后，实验组给予不同浓度的实施例1提供的鸡胚活性肽(20，50，100，250,500μg/mL)处理细胞；空白对照组不添加活性肽。继续培养48小时。在培养结束前4小时每孔加入20□LMTT20□LMTT(5μg/mL)。产生的紫色结晶用DMSO溶解，在550nm波长条件下测定光吸收值。以空白对照的吸光值为100％，计算各组细胞的相对空白对照组细胞的活性。结果如图1。

结果表明，当鸡胚活性肽的剂量为20～100μg/mL时，成纤维细胞的活性与空白对照组无显著差异(p>0.05)；而当鸡胚活性肽的剂量为250～500μg/mL时，成纤维细胞的活性与空白对照相比显著升高(p<0.05)，升高比例分别为20％和40％。以上结果说明，鸡胚活性肽能够促进成纤维细胞的活性，在250～500μg/mL剂量范围内皆有效。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。