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第七届海内外生命科学论坛

第七届海内外生命科学论坛

  • 召开年:2002
  • 召开地:北京
  • 出版时间: 2002-05-28

主办单位:国家自然科学基金委员会;军事医学科学院

会议文集:第七届海内外生命科学论坛

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  • 摘要:当前生命科学在研究方法上面临着巨大的技术上和理论上的挑战,即如何从结构,功能和生物学过程调控的角度解释一个物种基因序列中所含的信息.这个问题的关键是研究判断一个未知基因的功能、与其他基因产物及其亚细胞结构之间的功能联系不能只通过对核酸一级结构的检测来确定.现就在上述背景下快速发展的蛋白质组学技术的现状、局限性、主要进展和今后展望作一简要综述.
  • 摘要:纤维蛋白原受体拮抗剂是当前抗血小板聚集药物研究的重要领域.利用同源模建方法构建纤维蛋白原受体的结构,并在序列比对和分子模建的基础上,推测并确定纤维蛋白原及其受体相互作用的结构域;将纤维蛋白原受体的结构域作为双杂交系统中的X融合到DB上,纤维蛋白原的结构域作为Y融合到AD上,利用GAL4酵母双杂交系统3试剂盒,以AH109酵母株为指示系统,以GBBKT7和pGADT7为克隆载体,分别进行杂交融合蛋白的基因克隆和表达,进一步验证纤维蛋白原及其受体相互作用的结构域的准确性;再利用含生长表型相反的URA3报告基因的酵母株MV103(由美国Johns Hopkins大学医学院的Jef D.Boeke教授赠送),进一步验证纤维蛋白原及其受体相互作用的结构域的准确性;并利用该酵母反双杂交系统检测纤维蛋白原受体拮抗剂的抑制活性.本项目采用了先进的药物研究方法,研究内容涉及到当前生命科学的前沿领域(包括高通量筛选、基因工程等),研究目的是建立起一套完整的高通量药物筛选系统,希望获得具有抗血小板聚集活性的纤维蛋白原受体拮抗剂.
  • 摘要:在大肠杆菌中表达了戊型肝炎病毒(HEV)ORF2的aa394-aa604片段,得到的重组蛋白NE2在SDS-PAGE中主要以可被尿素解聚的二聚体形式存在,二聚体对病人血清的反应性明显强于单体;质谱分析表明NE2可形成从二聚体到至少六聚体的多种聚体;动态光散射测定表明平均分子半径约4 nm,相当于四聚体,但分散度较大,提示为多种大小不一的聚合体的混合物.这些证据表明NE2蛋白可形成以同源二聚体为基本单位的多种聚合体形式,其中以二聚体间的结合最为紧密,并且以二聚体为基础可进一步装配出多种更高级结构,从而具有作为HEV疫苗及诊断试剂抗原的良好前景.
  • 摘要:以水泡性口炎病毒(VSV)的L基因为模板,应用半套式(semi-nested)聚合酶链反应(PCR)技术,设计一对外侧引物及一条半套式引物,对细胞培养物和人工感染豚鼠足部水泡液和不同时期的血液进行检测.设立细胞阴性对照和空白对照,同时用相关和相似病毒FMDV,BEFV和BTV等病毒作扩增比较.扩增产物经电泳分析结果表明,其大小与设计的引物间的序列大小基本一致,外侧引物扩增出243 bp片段,半套式引物扩增出135 bp片段,所有对照扩增呈阴性.对扩增物经序列分析,与VSV L基因的把序列完全一致.对各种样品的检测均可在6 h内完成.证实该方法是特异、敏感、安全、快速,并能进行VSV毒型鉴定的检测技术.
  • 摘要:纤维蛋白原受体拮抗剂是当前抗血小板聚集药物研究的重要领域.利用同源模建方法构建纤维蛋白原受体的结构,并在序列比对和分子模建的基础上,推测并确定纤维蛋白原及其受体相互作用的结构域.构建同时具有活化血小板导向性和纤维蛋白原受体拮抗作用的新型融合蛋白膜联蛋白Ⅴ-巨蛭蛋白(annexinⅤ-decorsin).在深入进行融合蛋白分子设计、优化和结构模建的基础上,构建并在大肠杆菌中高效表达了膜联蛋白Ⅴ-巨蛭蛋白-C端融合蛋白和膜联蛋白Ⅴ.通过对一系列不同长度的巨蛭蛋白-C端的设计,并对其进行膜联蛋白V-巨蛭蛋白-C端融合蛋白的分子构建以及融合蛋白与纤维蛋白原受体复合物的相互作用关系研究,能量分析结果显示,膜联蛋白V-巨蛭蛋白12~39aa可能具有较好的纤维蛋白原受体拮抗活性.这还有待于对膜联蛋白Ⅴ-巨蛭蛋白12~39aa融合蛋白分子进行一系列生化性质分析和药理活性检测.希望重组膜联蛋白Ⅴ-巨蛭蛋白12~39aa融合蛋白既保留了膜联蛋白Ⅴ和血小板结合的性质,又具有明显的纤维蛋白原受体拮抗活性,而且具有较高的抗血小板聚集活性.
  • 摘要:蛋白质组学方法是直接观察组织细胞中所有蛋白表达状态的高通量研究方法.通过比较在不同病理、生理状态下、不同外因刺激下细胞、组织蛋白的表达图谱,可能发现与特定生命现象相关的蛋白质.本文中应用这一方法分析了食管癌组织与配对的癌旁组织间差异表达的蛋白.肿瘤细胞或癌旁食管上皮细胞通过显微切割方式从组织冰冻切片中获得,提取其总蛋白进行二维电泳.电泳胶被银染显色,应用Imagemarster 2-D Elite软件对获得的蛋白图谱加以分析,寻找癌与癌旁组织差异表达的蛋白,最后用质谱技术测定目的蛋白的肽质指纹谱.本研究共分析了34例食管癌及其配对的癌旁组织,发现并鉴定了29个差异表达的蛋白.其中9个在食管癌组织表达上调,包括HSP27、MHCⅠ等;20个在癌旁组织中高表达,如膜联蛋白(annexin)Ⅰ、膜联蛋白Ⅴ等.根据已有的资料提示,这些蛋白分别与细胞增殖、细胞凋亡、免疫反应、转录调控等相关.以上结果表明蛋白质组学方法将会在肿瘤发生、发展机理的研究方面发挥重要作用,通过这种方法鉴定的肿瘤异常表达蛋白可能成为肿瘤诊断及预后判断的标志物.
  • 摘要:以疯牛病和人类克雅病(CJD)为代表的可传播性海绵状脑病(TSE)为一类致死性神经系统疾病.其感染因子是一种与正常细胞膜蛋白(PrPC)一级结构完全相同,但高级结构、理化特性不同的PrPSc或prion蛋白.目前的研究提示这种不含有核酸的prion蛋白似乎具有自身复制的能力,即蛋白本身就储存了生命活动必须的遗传信息.同时与传统的微生物相似,TSE又具有明显的"毒株"现象.因此对TSE感染因子的确定有可能证实在自然界中还存在着一种全新的微小生命体,从而改变人类对整个生物界的认识.Prion学说的出现使得蛋白质不仅可体现生物学功能,而且可储存遗传信息.而核酸成分可能在prion复制过程中完全缺如.因此对这一论点的确立将有力地挑战目前的"生物中心法则",丰富或改变人类对生命过程的认识.
  • 摘要:目的:Gβ亚基可以作为相对独立的结构和功能单位与其效应器蛋白结合而引发一系列生化反应,但在Gβγ亚基二聚体中,Gγ亚基的存在可以影响Gβ亚基的结构及其与下游蛋白因子的结合,为了探寻能与Gβγ亚基二聚体相结合的新的蛋白因子,我们选择了以Gβ和Gγ为饵质粒,具有高灵敏度的研究蛋白间相互作用的酵母三杂交系统进行研究.方法:利用酵母三杂交体系,分别构建含Gβ1、Gγ2基因片段的饵质粒,共转染酵母细胞Y190感受态,筛选人脑cDNA文库;并进一步在哺乳动物细胞中用免疫共沉淀法对酵母三杂交筛选的阳性克隆进行的鉴定.结果:获得了能与Gβγ亚基二聚体相结合的新的蛋白因子,并在哺乳动物细胞中验证了这种相互作用;另外还获得了3条编码能与Gβγ亚基二聚体相结合的未知蛋白因子的cDNA序列(已被GeneBank收录,收录号分别为:AF456477,AF456478,AF456479).结论:在人脑中,Gβγ亚基二聚体能够通过一些新的蛋白因子参与细胞信号传导.
  • 摘要:酶法分析是分析生物技术中的主要内容之一,包括酶试剂盒、酶联免疫(ELISA)、酶标基因探针、酶传感器等等,已经在临床诊断、生物工艺过程分析与监控、环境监测、检疫、生命科学研究等方面逐渐取代传统的化学分析法.分析用酶之所以被青睐,归功于酶分子高度特异性和高催化效率,使微观生物学反应过程得以放大.然而,天然酶蛋白分子并非完无缺,它们或太"娇嫩",热稳定性差,容易受抑制,受蛋白酶水解而失活,或催化性能不理想,固定化回收活力低下,等等,导致许多分析用酶还未能实际发挥作用.特别具有很多优点的固定化酶分析法和各类酶传感器,并没有获得广泛应用.如何能够对酶蛋白实施分子改造,使它们的性能得到改善,是具有挑战性的课题.化学修饰法曾经是主要的手段,但盲目性比较大,效果常常不理想.分子酶工程学(molecular enzyme engineering)是近年发展起来的新的学科领域,其基础是结构生物学和生物信息学,尤其是利用蛋白质超分子结构知识,采用基因工程和蛋白质工程手段,对天然酶实施定向改造和体外分子进化,在开发新型、高质量分析酶试剂方面意义重大.本文重点介绍近期在作者实验室的研究进展,包括:(1)大肠杆菌碱性磷酸酶的定向改造与分子体外进行;(2)固定化酶空间取向控制的"锚链"(anchor-chain)模型;(2)顺序酶反应融合蛋白分子系统的构建;(4)免疫酶光开关;(5)增强电子传递速率的融合酶分子系统,等等.这些研究成果不仅在生物传感、蛋白质芯片和酶标等分析生物技术中有重要应用价值,而且为发展其他的分析酶系统提供了一些新的技术思路和模式方法.
  • 摘要:提出了一个简单快速的从头算的折叠预测算法,这一方法完全基于物理原理,从根本上有别于其他的利用同源性建模,刻纹(threading)和基于对已知晶体结构作统计比较等的结构预测方法.算法类似于能量优化算法.但也不需要像传统的做法那样从刚性的或半刚性的二级结构开始然后再组装成紧凑的三级结构.在我们的最陡下降优化算法中,"相对熵"(见正文定义)代替了体系的哈密顿.这一改变导致的结果是使本方法实质上是在按照Boltzmann分布的构象空间中搜索最大可能的构象,因而它更接近于从自由能的角度考虑体系的优化.其中只用到了蛋白质主链上的两两连续的Cα原子间的距离信息以及20种氨基酸的接触势的一个扩展形式,在扩展的接触势里附加了一个起近邻排斥作用的类似于van der Waals的约束势.在格子和真实蛋白质上对算法做了测试,预测过程的初始结构从充分去折叠后得到的线团开始,得到了一致的较好的模拟预测结果,4个蛋白质例子的预测构象相对于它们天然结构的均方根偏差(RMSD)在5~7(A)间,并保持了天然结构中部分主要的二级结构.从原理上讲,本方法是对能量优化的改进.它还具有势函数简单和计算快速的优点.本方法与其他方法的不同之处也作了讨论.
  • 摘要:目的:探讨TLR4胞内区PRO712HIS突变体引起LPS耐受现象可能的机制.方法:蛋白同源模建和物理化学参数分析.结果:Pro12His突变体溶液可及表面的亲疏水性质有明显变化,突变体的疏水性明显降低,且相应位置所带的电荷从中性变为正电荷.结论:可以推测TLR4胞内区在发生作用时,起主要作用的是疏水性作用,下一个接头蛋白MyD88与TLR4胞内区相互作用的部位应当是一个有较强疏水作用的区域.当Pro12His突变体出现时,由于电荷的排斥,疏水作用无法达到点突变以前的强度,两个蛋白的结合不能得以实现,信号无法继续传递.从而出现对LPS的耐受现象.
  • 摘要:顺序酶电极是生物传感器的一大类群,其原理是利用数种相关酶,顺序、协调地催化一系列反应,完成单酶传感器难以进行的检测项目.据检索从1990年至2000年的世界生物传感学术大会的论文摘要,在目前已经报道的100多种生物传感器中,30%以上采用顺序酶传感器法.然而,与单酶传感器相比,顺序酶传感器普遍存在稳定性、互换性和灵敏度较差等问题.本研究以麦芽糖传感器为例,采用基因操纵,实现糖化酶(GA)和葡萄糖氧化酶(GOD)的融合,制备融合蛋白顺序酶麦芽糖传感器,建立了融合蛋白制备顺序酶传感器的模式方法. 通过基因水平的分子操纵,将黑曲霉GOD基因、连接肽(Ser-Gly)5编码序列和黑曲霉GA基因依次拼接,获得GOD-(Ser-Gly5)-GA(GLG)融合基因.将融合基因重组进大肠杆菌-酵母穿梭质粒pPIC9,实现其在甲基酶母巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)中的高效表达.融合蛋白GLG分子量高达410 kD,经QsepharoseTM Fast Flow 阴离子交换柱一步纯化就达电泳纯.动力学性质分析表明,GLG基本保持了GA和GOD的原有活力,且与酵母产生的GA和GOD具有相似的催化动力学特性.将GLG和相同活力的GA和GOD混合物(GA/GOD)同时固定在戊二醛修饰过的玻片上,GLG的顺序催化效率远远高于GA/GOD,体现了融合蛋白在固定化方面的优势.分别用GLG和GA/GOD制备麦芽糖传感器,并将两种传感器的性能进行了比较分析.结果表明,GLG可有效提高麦芽糖传感器的信号强度、线性范围及酶膜的互换性,使麦芽糖传感器的性能得到明显改善. 本研究将融合蛋白技术引入生物传感器的研究,成功地构建了具有双酶活力的融合蛋白,以实现顺序作用酶控制的共固定化,建立了融合蛋白技术制备顺序酶传感器的模式方法,为解决顺序酶传感器灵敏度和互换性差的难题提供了新的途径,同时也为解决其他顺序酶反应的低效率问题提供了一种新思路.
  • 摘要:蛋白质组学(proteomics)是研究细胞内蛋白质组成及其活动规律,对不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的研究.本文简要综述了蛋白质组研究的理论基础和方法手段,并介绍了蛋白质组学研究在动物科学中的应用.
  • 摘要:本文利用同步荧光光谱技术,对胰岛素的同步荧光光谱特征进行研究,在波长差△λ为80 nm时,胰岛素分子中酪氨酸和色氨酸残基的荧光峰可以分辨开,通过对不同浓度下以及在二硫苏糖醇作用下同步荧光光谱的变化,对胰岛素分子构象的变化和结构的去折叠进行表征.
  • 摘要:本文采用圆二色波谱仪(CD)分析了被CMV侵染的番茄细胞膜蛋白结构的变化,以及吴茱萸抽提物对感病番茄细胞膜的作用.结果发现,被CMV侵染的番茄细胞膜蛋白分子二级结构发生了变化,表现为α-螺旋的减少和β-转角的增加;吴茱萸抽提物处理被病毒感染的番茄细胞膜,与对照相比,其蛋白分子二级结构发生了变化,药剂作用比感病样品的细胞膜蛋白的二级结构中α-螺旋成分比例增加,而β-转角比例相应减少.
  • 摘要:基因组是生命体遗传信息的载体,而蛋白质组是生命活动的执行体。生命体的统一性在于基因组,生命体的复杂性在于蛋白质组。本项目将通过对神经内分泌、造血、神经损伤等重要生理病理过程的组成性蛋白质组学分析及心血管、肿瘤等重大疾病的比较蛋白质组学研究,在蛋白质组水平上为其预警、诊断、治疗与预防提供新的思路和新的策略。从选题方面,将研究重点集中在影响我国人民健康的重大疾病,如心血管病、肝癌、神经系统疾病等。在我国即将到来的老龄化社会中,老年痴呆症、帕金森症等神经系统疾患的危害将日益突出。因此开展对上述疾病的蛋白质组学研究势在必行。
  • 摘要:蛋白质是生命活动的主要承担者,一切生命活动无不与蛋白质有关.新陈代谢是生命活动的主要特征,而构成新陈代谢的所有化学变化,都是在酶的催化之下进行的,除最近发现的极少数具有催化功能的核糖核酸以外,所有的酶都是蛋白质.生物体的各种活动,如生长,运动,呼吸,免疫,消化,光合作用,以及对外界环境变化的感知并作出必要的反应等,都必须依靠蛋白质来实现.虽然遗传信息的携带者是核酸,但遗传信息的传递和表达不仅仍然是在酶的催化之下,并且也是在各种蛋白质的调节控制之下进行的.
  • 摘要:目的:分析、比较HPV-11之L1蛋白的B细胞优势表位,为制作针对L1的亚单位多肽疫苗奠定基础.方法:分别采用Goldkey和PC/Geng软件系统,寻找L1蛋白的B细胞表位,最后用抗原性指数(AI)综合评判L1蛋白的B细胞优势表位;Chousman方案预测L1蛋白之二级结构.结果:L1分子中,呈转角结构(T)、伸展结构(E)、无规卷曲结构(C)、螺旋结构(H)的氨基酸残基分别占27.54%、32.34%、20.76%、19.36%.第18-38位、40-60位、118-138位、340-360位、420-440位、480-501位的氨基酸序列具有较强的抗原性;第120-140位、345-360位、420-440位、480-501位的氨基酸序列是理想的B细胞表位;第426-439位和第487-201位的抗原性指数分别为0.0508和0.0578.结论:HPV-11之L1蛋白的二级结构与其抗原性有关,而后者与B细胞优势表位有关,以此表位设计合成的多肽疫苗,可望具有刺激产生抗体的能力.
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