CRISPR/Cas9

摘要： Axon regeneration of central neurons is a complex process that is tightly regulated by multiple extrinsic and intrinsic factors.The expression levels of distinct genes are changed after central neural system(CNS)injury and affect axon regeneration.A previous study identified dusp2 as an upregulated gene in zebrafish with spinal cord injury.Here,we found that dual specificity phosphatase 2(DUSP2)is a negative regulator of axon regeneration of the Mauthner cell(M-cell).DUSP2 is a phosphatase that mediates the dephosphorylation of JNK.In this study,we knocked out dusp2 by CRISPR/Cas9 and found that M-cell axons of dusp2(-/-)zebrafish had a better regeneration at the early stage after birth(within 8 days after birth),while those of dusp2^(+/-)zebrafish did not.Overexpression of DUSP2 in Tg(Tol 056)zebrafish by single-cell electroporation retarded the regeneration of M-cell axons.Western blotting results showed that DUSP2 knockout slightly increased the levels of phosphorylated JNK.These findings suggest that knocking out DUSP2 promoted the regeneration of zebrafish M-cell axons,possibly through enhancing JNK phosphorylation.

摘要： 背景:HLA-DR基因异常表达与多种肿瘤的进展及预后相关,采用CRISPR/Cas9技术编辑子宫内膜癌HLA-DRA基因的研究目前国内外尚未见报道。目的:利用CRISPR/Cas9技术对HEC-1-A细胞的HLA-DRA基因靶向敲除,检测其敲除效率,并初步探索HLA-DRA基因的功能。方法:根据HLA-DRA基因序列,针对HLA-DRA外显子设计单链向导RNA(sgRNA),分别将sgRNA、CRISPR/Cas9、增强绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性克隆至YKO载体中,通过脂质体将sgRNA表达质粒转染到HEC-1-A细胞中。根据荧光表达,观察评估sgRNA敲除效果后,使用表达sgRNA的质粒进行转染,用最佳浓度的嘌呤霉素筛选,获得稳定的绿色荧光蛋白阳性表达细胞后,进行PCR、基因测序、转录组测序。结果与结论:经转染和嘌呤霉素筛选后,获得稳定表达绿色荧光蛋白的HEC-1-A细胞,对其进行Sanger测序分析,结果显示HEC-1-A细胞中HLA-DRA第一号外显子基因被定向敲除,对转录组测序结果进行差异基因筛选,根据筛选所得686个差异表达基因进行GO富集分析和KEGG富集分析,构建蛋白互作网络图,通过对肿瘤增殖分化有关差异基因分析发现COL3A1、BCL2A1、TACSTD2、CXCR2等基因表达上调,GNG11、BMP7、IL1RN、PLEK2、CDH6等基因表达下调。结果可见,HLA-DRA基因参与了多种器官、组织和细胞的功能调控过程。此外,HLA-DRA基因可能通过2种途径(上调/下调)调控子宫内膜腺癌细胞的增殖、分化、迁移及侵袭过程。此研究建立了CRISPR/Cas9技术联合脂质体转染子宫内膜癌细胞的单质粒基因敲除方法,首次敲除子宫内膜癌免疫相关基因HLA-DRA,为子宫内膜癌免疫治疗的研究奠定实验基础。

摘要： Cancer progression involves the sonic hedgehog(SHH)pathway,in which the receptor PTCH1 actives the downstream pathways.Dysfunction of PTCH1 can lead to nevoid basal cell carcinoma Syndrome(NBCCs)including neoplastic disease and congenital disorder.To evaluate the relationship between PTCH1 and cancer,we applied the CRISPR/Cas9 system to knock out PTCH1 in oral nontumorous epithelial cells(GMSM-K).Then we screened six PTCH1 variants associated with cleft lip/palate(CL/P),one of the congenital disorders in NBCCs,and generated PTCH1 variant and wild-type recombinant PTCH1^(−/−)GMSM-K cell lines.Transcriptome sequencing was conducted in these cell lines.The results revealed that differentially expressed genes(DEGs)in PTCH1^(−/−)GMSM-K were enriched in extracellular compartments,contributing epithelial diseases by pathway enrichment analysis.RT-PCR confirmed that KRT34,KRT81,KRT86,PDGFB,and WNT10B genes,associated with extracellular compartments were highly expressed in PTCH1^(−/−).The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes analysis also suggested that DEGs are closely related to focal adhesion,transcriptional misregulation,and proteoglycans in breast and gastric cancers.Comparative analysis of samples revealed that the CL/P-associated PTCH1 variants A443G and V908G are potentially carcinogenic.These findings provide new insights into the carcinogenic potential of PTCH1 dysfunction.

摘要： 生长素极性运输在植物生长发育中发挥着重要作用,生长素输出载体蛋白(PIN-FORMED,PIN)是控制生长素极性运输的关键蛋白。虽然部分水稻OsPIN基因功能已有报道,但水稻OsPIN5c的生物学功能仍有待研究。本研究在OsPIN5c第1外显子处设计靶点并构建CRISPR/Cas9载体,通过转化粳稻品种日本晴获得24株转基因植株,PCR产物直接测序分析表明其中15株发生突变,突变率为62.5%,突变类型为双等位突变;进一步从T1代突变体中筛选获得3种不同的纯合突变体,将其命名为ospin5c-1、ospin5c-2和ospin5c-3。序列比对分析表明,这3种类型的突变均造成移码突变和蛋白翻译提前终止,由原来的398个氨基酸分别缩短为109、106和250个氨基酸;跨膜螺旋结构域分析表明,3种突变体中OsPIN5c蛋白的跨膜结构完全消失;蛋白结构预测表明3种突变体中OsPIN5c蛋白螺旋结构明显减少。突变体的苗高、根长和不定根数均显著低于野生型植株。组织特异性表达表明OsPIN5c主要在根中表达。突变体根中OsPIN1a和OsPIN5b表达量提高;生长素合成关键基因OsYUC1、OsYUC4、OsYUC6和OsYUC7的表达量也显著提高。ospin5c突变体根的向重性受到部分抑制。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得ospin5c纯合突变体并探讨了OsPIN5c基因功能,为利用OsPIN5c基因进行作物遗传改良提供了潜在的基因资源。

摘要： 甘蓝型油菜是我国一种重要的油料作物。MPK6是一种丝裂原活化蛋白激酶,MAPK级联途径可以被各种胁迫激活,进而调节植物对胁迫的响应,在植物响应非生物胁迫过程中发挥着重要的作用,但在甘蓝型油菜盐胁迫响应过程中的功能还尚不清楚。基因结构和蛋白序列分析表明,MAPK6在十字花科芸薹属植物种间分化相对保守,基因结构相似,蛋白之间均有相同的STKc_TEY_MAPK结构域,与胁迫和生长发育相关。为探究其功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术对BnaMPK6基因进行编辑,通过农杆菌介导的方法将BnaMPK6基因转入到甘蓝型油菜中,获得了BnaMPK6基因4个同源拷贝同时突变的材料:cr-bnampk6-13-1和cr-bnampk6-49-1。cr-bnampk6突变体表现出明显的盐敏感性:在100 mmol L^(-1)和150 mmol L^(-1)浓度的NaCl溶液处理下,功能缺失突变体长势明显缓慢,并且株高和鲜重显著低于野生型植株,但根长无明显差异。此外,在盐胁迫下,功能缺失突变体体内的活性氧和丙二醛含量的积累显著高于野生型对照,脯氨酸含量也明显高于野生型植株。本研究结果表明,BnaMPK6基因在盐水胁迫下正向调控植株的生长和发育,影响甘蓝型油菜的耐盐性。本研究不仅为BnaMPK6基因调控甘蓝型油菜盐胁迫的研究提供了理论基础,而且为甘蓝型油菜耐盐性遗传改良提供了一定的技术支持。

摘要： 为探究MYB44基因在番茄生长发育中的生物学功能.本试验采用CRISPR/Cas9系统构建敲除突变体,根据MYB44基因的外显子设计sgRNA,酶切后与载体pKSE-401连接转化大肠杆菌,然后通过helper菌介导转移到农杆菌LBA4404中,形成重组菌,再应用农杆菌转化法将重组菌侵染番茄子叶外植体,经过抗生素的抗性培养基严格筛选,直至长出幼苗,最终提取DNA进行测序,获得3个独立的敲除转基因株系.

摘要： 为了揭示水稻中FT-like亚家族成员的生物学功能,采用CRISPR/Cas9技术对其中的OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6、OsFTL7和OsFTL11进行基因编辑.在5个基因的编码区各选择1个靶点构建1个融合的sgRNA表达框,将表达框装载到CRISPR/Cas9表达载体中,通过农杆菌介导的遗传转化法侵染水稻品种中花11的愈伤组织,得到转基因植株.利用靶点区域的特异性引物进行测序分析,得到3种不同类型的突变,分别为osftl4osftl5osflt6三突变体、osftl4osftl5osflt6osftl11四突变体和osftl4osftl5osflt6osftl7osftl11五突变体.这些突变均导致目标基因序列发生移码突变,进而影响氨基酸序列.观察突变体表型,发现3种类型的突变体均出现了叶片早衰的表型.

摘要： FLS2是一类在植物中保守存在的可识别细菌鞭毛蛋白并激活位于植物先天免疫反应第一层面的重要的植物模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)。为了进一步研究草坪草植物的先天免疫,本研究以冷季型草坪草模式植物二穗短柄草(Brachypodium distachyon)为材料,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对植物抗病免疫相关的重要基因BdFLS2进行了定向的基因编辑,获得了bdfls2敲除突变体,为草坪草植物的FLS2相关的先天免疫的进一步研究奠定了材料基础。筛选转基因阳性植株,测序分析bdfls2 突变基因,结果显示该突变体中bdfls2 基因编码序列由于碱基的缺失导致提前终止。同时该突变体在对应病原相关分子模式(PAMPs:pathogen-associated molecular pattern)flg22处理后相比于野生型,无显著的ROS爆发或防卫基因的激活,暗示二穗短柄草FLS2能够识别病原相关分子模式flg22激活分子模式触发的免疫(pattern-triggered immunity,PTI)。

摘要： 转录因子E2相关因子2(Nrf2)是细胞重要的调节抗氧化应激的转录因子,其活性状态与病毒感染引起的炎症及免疫清除相关。为研究Nrf2对马传染性贫血病毒(EIAV)复制的影响,本研究通过CRISPR在线设计工具,靶向于Nrf2设计2条特异性sgRNAs,经程序性退火后连接到LentiCRISPRv2-GFP载体中构建重组质粒并分别经测序鉴定正确后,转染HEK293T细胞,24 h后通过western blot筛选沉默Nrf2基因效率最高的sgRNA,结果显示,2条sgRNAs均具有较高的沉默效率。将重组质粒LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N1转染HEK293T细胞,利用流式细胞仪筛选表达GFP的单细胞克隆,并扩大培养后,经western blot和测序鉴定,筛选到2株不表达Nrf2的细胞,这2株细胞基因组均缺失一个碱基T,导致Nrf2基因发生移码突变而无法表达。选择其中一株细胞,将该细胞连续传代,选择第10代(G10)、15代(G15)、20代(G20)细胞经western blot鉴定其遗传稳定性,结果显示各代次细胞均未检测到Nrf2基因的表达,表明该敲除细胞系可稳定遗传,将其命名为HEK293T-Nrf2^(KO)细胞。将EIAV感染性克隆CMV_(3-8)及Nrf2基因回补的感染性克隆CMV_(3-8)+pVR_(1012)-flag-Nrf2分别转染HEK293T-Nrf2^(KO)细胞,24 h后收获细胞和上清,通过western blot分别检测细胞和上清中的病毒蛋白Gag及利用反转录酶活性试验(RT)检测上清中病毒的复制。western blot结果显示,与CMV_(3-8)转染的HEK293T细胞相比,转染CMV_(3-8)的HEK293T-Nrf2^(KO)细胞和上清中病毒蛋白Gag表达均上调约1.5倍,而转染CMV_(3-8)+pVR_(1012)-flag-Nrf2HEK293T-Nrf2^(KO)细胞和上清中的病毒蛋白Gag表达下调约50%;RT的检测结果与western blot的检测结果一致。结果表明Nrf2基因可以抑制EIAV在HEK293T细胞中的表达。通过将相关质粒转染HEK293T细胞包装EIAV假病毒,并将其分别感染HEK293T和HEK293T-Nrf2^(KO)细胞24 h后,分别检测病毒的荧光素酶信号,结果显示,与对照组相比,感染假病毒的细胞病毒复制能力显著增强。进一步表明,敲除Nrf2基因有助于病毒对细胞的感染。以上结果表明,Nrf2能够抑制EIAV在HEK293T细胞中的复制。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建的敲除Nrf2基因的HEK293T细胞系,可以用于研究宿主Nrf2对EIAV复制的影响,本研究首次证实了宿主Nrf2可以抑制EIAV的复制。本研究构建的HEK293T-Nrf2^(KO)细胞系为宿主Nrf2调控EIAV复制机制的研究提供了有效工具。

摘要： 规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeat,CRISPR)及其相关蛋白(Cas)系统是一种新型的基因编辑技术,具有操作简单,编辑高效率等优点,在基因治疗、制作抗体药物、构建模式动物等领域广泛应用。山羊和绵羊作为重要的家畜类型,CRISPR/Cas9基因编辑技术出现后,在山羊、绵羊的遗传修饰中得到迅速应用。本文概述了CRISPR/Cas系统的发展历程、组成及分类、作用方式和原理,总结了CRISPR/Cas系统近年来在提升山羊和绵羊生产性能方面的应用,并对该技术的发展前景作简要阐述,以期为解决畜禽种业的瓶颈问题以及我国畜禽种业的快速、健康和持续发展提供参考。

摘要： 本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9技术纠正猪KIT基因结构突变的方法，包括通过CRISPR/Cas9技术构建分别靶向猪KIT基因内含子16和内含子17的打靶载体，转染猪肾细胞，使猪KIT基因实现拷贝删除，其中构建所述打靶载体所用的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4中的任一项所示。本发明的方法简单易行，通过能够有效靶向，实现目标基因拷贝数的精确删除。

摘要： 本发明公开了一种CRISPRCas9介导的定点碱基替换在植物中的应用。本发明提供了一种定点编辑植物基因组的系统，该系统包括BE3植物表达载体(表达由nCas9(D10A)、脱氨酶和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制蛋白组成的融合蛋白)，并以水稻OsPDS和OsSBEIIb为靶基因对该系统进行验证。结果表明，在所选的3个靶点中，均获得预期定点突变植株，在水稻中实现了碱基的精确的点突变，且效率最高达到20％左右，为农作物育种提供了一种可行的有效的碱基替换方法，在农业育种方面具有强大的应用潜力，为快速改良农作物重要农艺性状提供了基础。

摘要： 本发明公开了一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明构建敲除质粒PHY300dsrf，该质粒包含特异性靶向目的基因的sgRNA、cas9基因、同源修复臂、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的复制原点及抗性筛选标记。本发明所设计的特异性靶向srfA‑C基因的sgRNA，可以指引cas9蛋白在srfA‑C基因的特异性位点切割双链，然后再同源修复臂的指导下对基因组进行精确地同源性重组，在断裂处引入XhoI酶切位点。在对srfA‑C基因敲除成功的枯草芽孢杆菌进行上罐发酵培养，泡沫显著减少，证明该CRISPR/Cas9基因编辑系统可以有效的对枯草芽孢杆菌基因组进行基因编辑。

摘要： 本发明涉及病毒检测技术领域，且公开了一种PPV检测的crRNA引物对、CRISPRCas12a系统及应用方法，包括以下步骤：S1、组织样品的处理：将称取约1g的各组织样品，加入1mL PBS后放入研磨钵中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以12000rpm/min离心3min；S2、病毒核酸的提取：使用某生化科技有限公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒对病毒进行核酸提取；S3、引物设计：在GenBank中检索猪细小病毒全基因组(GenBank ID:NC_001718.1)，通过Meglign软件分析比对，确定猪细小病毒全基因组中高度保守片段为VP2基因，使用Primer Premier 5软件，设计VP2基因的全长引物，根据猪细小病毒全基因组中高度保守片段VP2基因，使用CRISPR‑DT网站中Cpf1引物设计软件设计猪细小病毒VP2基因的crRNA引物，并委托某生物公司合成生产。

摘要： 本发明公开了一种基于CRISPRCas12a系统的miRNA‑21检测方法，包括以下步骤：合成正向切口引物、反向切口引物以及对应的向导RNA；对所述正向切口引物和反向切口引物进行等温扩增；将等温扩增后的产物以及所述向导RNA，采用CRISPRCas12a系统进行检测，获得miRNA‑21检测结果。本发明属于生物检测技术领域，可在短时间内实现对miRNA‑21的高灵敏、高特异性检测。

摘要： 本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种用于检测细菌的试剂盒及基于CRISPR/Cas‑SDA‑AuNPs的细菌检测方法。本发明引入CRISPR‑Cas系统，通过CRISPR/Cas12a特异性识别细菌和SDA进行检测信号放大，提出了基于CRISPR/Cas12a‑SDA和DNA‑AuNPs光热效应的细菌检测方法，可以实现对细菌的简便、快速、高灵敏检测。

摘要： 本发明公开了一种基于点击化学末端转移酶及CRISPRCas12a对miRNA的检测方法。首先，靶标miRNA‑21作为模板，将两个核酸探针进行点击化学连接，其生成物可与磁珠(MBs)结合。然后用TdT对其连接的核酸探针和互补链miRNA‑21进行延伸。延伸出的poly‑T尾巴激活了CRISPR/Cas12a的反式切割能力，从而切割报告基因来产生荧光信号。microRNAs(miRNAs)检测的特异性和灵敏性在癌症的早期诊断和各种疾病的治疗中起着至关重要的作用。

摘要： 本发明公开了一种基于CRISPRCas9高效快速连续基因编辑方法，首先将CRISPRCas9质粒pRedCas9‑N20转入目的菌株，再将体外扩增的带有PAM以及抗性marker序列的donor片段导入大肠杆菌，配合CRISPRCas9质粒基于Red同源重组将带有PAM序列的donor整合入基因组，再通过配合CRISPRCas9对PAM序列进行切割，再进行同源重组DSB修复，将标记maker消除，以及基因组无痕编辑，如果还需继续编辑，只需重新设计线性片段，无需再设计PAM序列，同样用于编辑使用的质粒可大量准备，用于多个菌株编辑，且本发明编辑效率高，单基因编辑时间短，编辑出的PAM序列固定。

摘要： 隐性雄性不育在植物育种中具有重要利用价值，水稻中TDR基因功能缺失会引起彻底的隐性雄性不育，因而是基因工程创制隐性雄性不育的重要靶标。本发明公开了一种利用CRISPRCas9系统对水稻TDR基因进行定点突变的方法，通过本发明提供的定点突变方法可快速高效地创制TDR基因突变体从而获得隐性雄性不育材料；本发明进一步提供了一种对通过前述定点突变方法获得的特定TDR突变基因型进行检测的方法，可用于快速鉴定TDR定点突变当代转化子中靶位点是否存在突变，亦可用于后代特定突变基因型的基因分型鉴定。

摘要： 本发明公开了一种CRISPRCAS9技术构建MyoD1基因敲除的MDBK细胞系的方法，该方法利用携带MyoD1基因的sgRNA病毒液感染MDBK细胞敲除MyoD1基因，MyoD1基因敲除的MDBK细胞可于下游研究MyoD1基因的功能及与其相关的调控机制或通路。