巢式PCR

摘要： 为探明云南蔗区甘蔗白叶病植原体的昆虫介体及优势种群,丰富甘蔗植原体病害相关理论和技术基础,制定适用于甘蔗白叶病的综合防控措施,2019年采用寻集法和扫网法对甘蔗白叶病发病最为严重的云南省临沧市耿马蔗区进行甘蔗白叶病植原体昆虫介体调查和巢式PCR检测分析。调查检测结果显示,采集到的大青叶蝉(Tettigoniella viridis)和条纹平冠沫蝉(Clovia conifer)2种昆虫介体均被检测为阳性,是甘蔗白叶病植原体的自然携带者,说明2种叶蝉可能为甘蔗白叶病植原体潜在昆虫介体;大青叶蝉若虫呈强阳性,初步确定为优势种群。鉴于目前云南蔗区甘蔗白叶病植原体传播方式主要是带毒蔗种和叶蝉类昆虫介体,建议建立甘蔗无病健康种苗繁育基地,及时杀灭蔗园中叶蝉类昆虫介体,从源头上控制甘蔗白叶病的扩散蔓延,降低田间自然传播速度。

摘要： 旨在提高新发现的牛丙型肝炎病毒毒株——广东湛江毒株(bovine hepacivirus-GDZJ,BovHepV-GDZJ)的检测及诊断能力,初步了解广东地区蜱携带BovHepV-GDZJ的情况,本研究结合宏转录组学、高通量测序及PCR技术,针对高通量测序结果中丰度高的基因区域,设计该病毒的巢式PCR特异性引物。通过优化巢式PCR方法的最佳退火温度,建立检测BovHepV-GDZJ的特异性巢式PCR检测方法。结果显示:本方法对该病毒标准质粒最低检测值为6.8 copies·μL^(-1);对沙粒病毒等蜱携带的常见病原均无反应;应用此方法对115份广东湛江的蜱样品进行了检测,测序结果显示,该批蜱携带BovHepV阳性率为46.08%(53/115)。本研究首次在蜱中检测到BovHepV,揭示了BovHepV可能的传播途径,并建立了一套针对BovHepV-GDZJ株的特异性巢式PCR检测方法,为广东地区检测和预防BovHepV提供技术帮助,也为控制BovHepV的流行提供参考。

摘要： 为确定贵州主栽樱桃品种玛瑙红、黑珍珠发生的花变叶、丛枝现象的病原分布、种类及其分类地位,本研究优化植原体16 S rDNA基因通用引物对R 16 mF 2/R 16 mR 2和R 16 F 2 n/R 16 R 2的巢氏PCR反应体系,同时对86个樱桃样品总DNA进行巢式PCR扩增,对扩增PCR产物进行克隆、测序及序列分析。结果表明,纳雍县、福泉市、乌当区等地样品植原体检出率高达100%;威宁县、沿河县、大方县分别为40.74%、66.67%和40%;序列同源性比较表明,获得的GZ-1、GZ-2植原体序列属于16 Sr V组;系统进化树及虚拟RFLP分析显示,GZ-1植原体序列属于16 Sr V-B亚组成员,GZ-2序列为16 Sr V组新的亚组。本研究确定了贵州主栽樱桃品种的植原体病害侵染情况,明确了其分类地位,为该病害检测和防控提供一定理论依据。

摘要： 东北虎(Panthera tigris altaica)是世界上体型较大的猫科(Felidae)动物,是我国一级保护动物。疾病防控对东北虎保护与繁育工作至关重要,目前关于东北虎重要病毒病的流行病学资料寥寥无几。传染性鼻气管炎是由猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus type 1,FHV-1)感染引起的一种上呼吸道疾病,且现有疫苗免疫后多出现再感染现象,对猫科动物健康造成一定危害。本研究采集50只东北虎全血样本,利用巢式PCR进行FHV-1检测,结果有10份样本扩增出明显目的条带,阳性率为20%;随机选取其中2株扩增FHV-1 gD基因全序列,获取的1125 bp序列与FHV-1参考株同源性为99.16%~99.56%,相比FHV-1参考株,获取序列有5个碱基位点发生了突变。研究结果丰富了圈养东北虎FHV-1流行病学数据,为圈养大型猫科动物的FHV-1监测提供了参考,有利于提高东北虎种群的保护成效。

摘要： 为促进马铃薯银屑病的分子生物学检测,从内蒙古牙克石地区马铃薯库房中采集了疑似马铃薯银屑病的样品,进行形态学鉴定,并对马铃薯银屑病分子生物学检测方法进行了筛选。结果表明,经形态学观察,块茎样品病斑特征符合“GB/T 28093-2001马铃薯银屑病菌检疫鉴定方法”中描述的病斑特征及病原菌特征。进一步利用常规PCR和巢式PCR对疑似样品进行了检测,两种方法均可扩增出特异性目的条带。目的序列经过测序,其序列与CBS640.85菌株(MH861907.1)序列的相似度达到100%。经形态学及分子生物学鉴定,可以证明在内蒙古牙克石地区马铃薯库房中采集的疑似马铃薯银屑病样品确为马铃薯银屑病,同时也证明本研究中采用的常规PCR和巢式PCR方法均可用于马铃薯银屑病的检测。

摘要： 间斑寇蛛Latrodectus tredecimguttatus的一个显著特点是其毒腺外组织甚至卵粒中也存在毒性成分.研究毒腺外的毒素不但可以加深对蜘蛛毒素的了解,而且可以发现具有重要应用前景的新型毒素分子.为了探究间斑寇蛛卵粒中低丰度表达的蛋白质类毒素,利用生物信息学方法从间斑寇蛛卵粒转录组中挖掘出一条编码多肽毒素的基因序列,利用基于3'-RACE和巢式PCR的策略成功克隆并异源表达了该基因.表达的多肽毒素命名为间斑寇蛛卵粒毒素-Ⅵ(Latroeggtoxin-Ⅵ,LETX-Ⅵ).生物学活性鉴定结果表明,LETX-Ⅵ能抑制ND7/23细胞膜上的钠离子通道电流和促进PC12细胞多巴胺的释放,但对美洲蜚棟Periplaneta americana和金黄色葡萄球菌及白色念珠菌等细菌和真菌不显示明显的毒性,说明LETX-Ⅵ是一种哺乳动物特异的神经毒素,在神经生物学研究工具试剂和相关疾病治疗药物的研发等方面具有潜在的应用前景.

摘要： 为了解南疆地区绵羊感染绵羊无浆体感染状况,试验从南疆4个地区(喀什、和田、阿克苏、巴音郭楞蒙古自治州)的21个县市采取绵羊血液样品,进行流行病学调查。对采集的637份血液样品中绵羊无浆体的16S rRNA进行巣式PCR扩增,并分析584 bp片段的阳性样品。结果表明:巴州、喀什、和田和阿克苏地区的感染率分别为75.8%、34.8%、23.3%和23.0%,平均感染率为33.3%;采样点各县市中感染率最高的为巴楚县91.4%,最低为阿瓦提县感染率10.3%,各地区感染率差异性较大。调查说明,新疆南疆地区属于绵羊无浆体病高发地区,急需采取科学防控措施。

摘要： 由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的黄栌(Cotinus coggygria)枯萎病可造成黄栌大量死亡,严重威胁北京香山公园的红叶景观.建立快速、高灵敏度的黄栌枯萎病菌(V.dahliae)检测技术对于黄栌枯萎病的防治具有重要意义.基于大丽轮枝菌特异性引物P1/P2扩增出的ITS序列设计3对巢式PCR引物,并根据其可扩增性和产物的特异性进行筛选.结果表明:以引物P1/P2为第一轮扩增引物,以PN1/PN2为第二轮扩增引物进行巢式PCR扩增,可检测出的DNA最低浓度为2.325×10-4 ng/μL,其灵敏度是普通PCR的100倍;研究建立的巢式PCR检测体系可为黄栌枯萎病的快速检测和早期诊断提供有效的方法.

摘要： 为了解南疆地区绵羊感染绵羊无浆体感染状况,试验从南疆4个地区(喀什、和田、阿克苏、巴音郭楞蒙古自治州)的21个县市采取绵羊血液样品,进行流行病学调查.对采集的637份血液样品中绵羊无浆体的16S rRNA进行巢式PCR扩增,并分析584 bp片段的阳性样品.结果 表明:巴州、喀什、和田和阿克苏地区的感染率分别为75.8％、34.8％、23.3％和23.0％,平均感染率为33.3％;采样点各县市中感染率最高的为巴楚县91.4％,最低为阿瓦提县感染率10.3％,各地区感染率差异性较大.调查说明,新疆南疆地区属于绵羊无浆体病高发地区,急需采取科学防控措施.

摘要： 犬隐孢子虫(Cryptosporidium canis)和微小隐孢子虫(C.parvum)是人兽共患病——隐孢子虫病的重要致病虫种,伴侣动物感染后,不仅会出现腹泻和炎症等临床症状,还会传染给人类.为了了解上海市闵行区犬只的隐孢子虫感染情况,在农村犬养户、宠物医院、动物收容点和犬养殖场共采集338份犬粪便样品,利用巢式PC R技术进行隐孢子虫小亚基核糖体RN A扩增分析.结果显示:被检样品中,3份隐孢子虫阳性(其中犬隐孢子虫2份,微小隐孢子虫1份),感染率为0.89％;来自于农村犬养户、宠物医院、犬养殖场和动物收容点的犬隐孢子虫阳性率分别为0.83％、0、0和3.57％,不同来源犬的感染率差异显著(P<0.05).调查结果表明:该区的动物收容点犬只和农村散养犬只均存在隐孢子虫感染情况,需加强日常监测与防控.

摘要： 目的：调查花卉培育土中嗜肺军团菌的污染状况。方法：于2009年7-9月，采集公共场所室内盆栽花盆中的花卉培育土、市售袋装花卉培育土和有机肥花卉培育土。巢式PCR方法扩增嗜肺军团菌种Mip基因，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。结果：花卉培育土中嗜肺军团菌总阳性率为51.9％(27/52)。盆栽花卉培育土、袋装花卉培育土和有机肥花卉培育土中嗜肺军团菌阳性率分别为9.1％(2/22)、75.0％(15/20)和100％(10/10)。结论：花卉培育土中存在嗜肺军团菌污染。

摘要： 目的：调查花卉培育土中嗜肺军团菌的污染状况。方法：于2009年7-9月，采集公共场所室内盆栽花盆中的花卉培育土、市售袋装花卉培育土和有机肥花卉培育土。巢式PCR方法扩增嗜肺军团菌种Mip基因，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。结果：花卉培育土中嗜肺军团菌总阳性率为51.9％(27/52)。盆栽花卉培育土、袋装花卉培育土和有机肥花卉培育土中嗜肺军团菌阳性率分别为9.1％(2/22)、75.0％(15/20)和100％(10/10)。结论：花卉培育土中存在嗜肺军团菌污染。

摘要： 目的：调查花卉培育土中嗜肺军团菌的污染状况。方法：于2009年7-9月，采集公共场所室内盆栽花盆中的花卉培育土、市售袋装花卉培育土和有机肥花卉培育土。巢式PCR方法扩增嗜肺军团菌种Mip基因，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。结果：花卉培育土中嗜肺军团菌总阳性率为51.9％(27/52)。盆栽花卉培育土、袋装花卉培育土和有机肥花卉培育土中嗜肺军团菌阳性率分别为9.1％(2/22)、75.0％(15/20)和100％(10/10)。结论：花卉培育土中存在嗜肺军团菌污染。

摘要： 目的：调查花卉培育土中嗜肺军团菌的污染状况。方法：于2009年7-9月，采集公共场所室内盆栽花盆中的花卉培育土、市售袋装花卉培育土和有机肥花卉培育土。巢式PCR方法扩增嗜肺军团菌种Mip基因，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。结果：花卉培育土中嗜肺军团菌总阳性率为51.9％(27/52)。盆栽花卉培育土、袋装花卉培育土和有机肥花卉培育土中嗜肺军团菌阳性率分别为9.1％(2/22)、75.0％(15/20)和100％(10/10)。结论：花卉培育土中存在嗜肺军团菌污染。

摘要： 目的：探讨集中空调系统嗜肺军团菌扩散传播途径。方法：2009年8月和9月选取江苏省南京市4家公共场所，采集集中空调冷却塔底泥、冷却水上清液、风管内壁积尘及塔旁和室内送风气溶胶，采用巢式PCR方法检测嗜肺军团菌并进行核酸序列系统发育分析。结果：共检测177件环境样品，冷却塔底泥、冷却水上清液、塔旁气溶胶、风管内壁积尘和室内送风气溶胶中嗜肺军团菌阳性率分别为100％，78.6％，25.4％，16.7％和17.3％，系统发育分析显示气溶胶与冷却水中嗜肺军团菌核酸序列相似性大于92％，具有不同集中空调系统特征的场所环境样品嗜肺军团菌的总阳性率差异没有统计学意义。结论：冷却水是嗜肺军团菌的主要污染源，可通过集中空调系统传播至室内空气中，且这一结果具有一定代表性。

摘要： 目的：探讨集中空调系统嗜肺军团菌扩散传播途径。方法：2009年8月和9月选取江苏省南京市4家公共场所，采集集中空调冷却塔底泥、冷却水上清液、风管内壁积尘及塔旁和室内送风气溶胶，采用巢式PCR方法检测嗜肺军团菌并进行核酸序列系统发育分析。结果：共检测177件环境样品，冷却塔底泥、冷却水上清液、塔旁气溶胶、风管内壁积尘和室内送风气溶胶中嗜肺军团菌阳性率分别为100％，78.6％，25.4％，16.7％和17.3％，系统发育分析显示气溶胶与冷却水中嗜肺军团菌核酸序列相似性大于92％，具有不同集中空调系统特征的场所环境样品嗜肺军团菌的总阳性率差异没有统计学意义。结论：冷却水是嗜肺军团菌的主要污染源，可通过集中空调系统传播至室内空气中，且这一结果具有一定代表性。

摘要： 目的：探讨集中空调系统嗜肺军团菌扩散传播途径。方法：2009年8月和9月选取江苏省南京市4家公共场所，采集集中空调冷却塔底泥、冷却水上清液、风管内壁积尘及塔旁和室内送风气溶胶，采用巢式PCR方法检测嗜肺军团菌并进行核酸序列系统发育分析。结果：共检测177件环境样品，冷却塔底泥、冷却水上清液、塔旁气溶胶、风管内壁积尘和室内送风气溶胶中嗜肺军团菌阳性率分别为100％，78.6％，25.4％，16.7％和17.3％，系统发育分析显示气溶胶与冷却水中嗜肺军团菌核酸序列相似性大于92％，具有不同集中空调系统特征的场所环境样品嗜肺军团菌的总阳性率差异没有统计学意义。结论：冷却水是嗜肺军团菌的主要污染源，可通过集中空调系统传播至室内空气中，且这一结果具有一定代表性。

摘要： 目的：探讨集中空调系统嗜肺军团菌扩散传播途径。方法：2009年8月和9月选取江苏省南京市4家公共场所，采集集中空调冷却塔底泥、冷却水上清液、风管内壁积尘及塔旁和室内送风气溶胶，采用巢式PCR方法检测嗜肺军团菌并进行核酸序列系统发育分析。结果：共检测177件环境样品，冷却塔底泥、冷却水上清液、塔旁气溶胶、风管内壁积尘和室内送风气溶胶中嗜肺军团菌阳性率分别为100％，78.6％，25.4％，16.7％和17.3％，系统发育分析显示气溶胶与冷却水中嗜肺军团菌核酸序列相似性大于92％，具有不同集中空调系统特征的场所环境样品嗜肺军团菌的总阳性率差异没有统计学意义。结论：冷却水是嗜肺军团菌的主要污染源，可通过集中空调系统传播至室内空气中，且这一结果具有一定代表性。

摘要： 目的：应用巢式PCR方法检测集中空调风管内壁积尘中嗜肺军团菌的污染情况。方法：于2009年8月抽取上海市四城区集中空调冷却水嗜肺军团菌阳性的公共场所，采集集中空调风管内壁积尘。巢式PCR方法扩增嗜肺军团菌种Mip基因，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。结果：共采集空调风管内壁积尘40份，嗜肺军团菌阳性样品11份，阳性率27.5％。四城区风管内壁积尘中嗜肺军团菌阳性率的差异没有统计学意义(x2=0.373，P=0.542)。当冷却塔与新风口直线距离处于0-4米范围内，风管内壁积尘中嗜肺军团菌的阳性率随距离增加有升高趋势。结论：巢式PCR方法检测积尘中嗜肺军团菌特异性较好，集中空调风管内壁积尘中存在嗜肺军团菌污染。

摘要： 目的：应用巢式PCR方法检测集中空调风管内壁积尘中嗜肺军团菌的污染情况。方法：于2009年8月抽取上海市四城区集中空调冷却水嗜肺军团菌阳性的公共场所，采集集中空调风管内壁积尘。巢式PCR方法扩增嗜肺军团菌种Mip基因，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。结果：共采集空调风管内壁积尘40份，嗜肺军团菌阳性样品11份，阳性率27.5％。四城区风管内壁积尘中嗜肺军团菌阳性率的差异没有统计学意义(x2=0.373，P=0.542)。当冷却塔与新风口直线距离处于0-4米范围内，风管内壁积尘中嗜肺军团菌的阳性率随距离增加有升高趋势。结论：巢式PCR方法检测积尘中嗜肺军团菌特异性较好，集中空调风管内壁积尘中存在嗜肺军团菌污染。

摘要： 一种蜱虫巢式PCR特异性引物及蜱虫巢式PCR鉴定方法，采用更为敏感的巢式PCR方法，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，通过在基因水平上进行蜱虫的分型、系统进化分析，本发明巢式PCR方法第一轮只需10个循环，第二轮需25个循环，缩短了简单的两轮普通PCR所需时间。

摘要： 本发明提供了一种锚定巢式多重PCR联合高通量测序检测基因融合的多重PCR引物，包括多重PCR特异性引物组1和多重PCR特异性引物组2，所述多重PCR特异性引物组1为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列组成的引物组，所述多重PCR特异性引物组2为SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:64所示的核苷酸序列组成的引物组。本发明还提供了一种锚定巢式多重PCR联合高通量测序检测基因融合的多重PCR引物和方法，本发明检测方法通用性更高，本发明检测方法能够在仅部分知晓或未知晓融合基因结构的情况下，准确灵敏地检测融合基因。

摘要： 一种立克次氏体巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法，本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，本方法检测非常方便快捷，并能提高检测方法的特异性及敏感性，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，针对立克次氏体的pCS20为靶基因的特异性区域，设计4条特异性引物，解决了现有PCR检测技术低特异性和低敏感性，扩增时容易产生假阳性、蜱虫体内立克次氏体含量较低时容易漏检的缺陷，本发明方法反应特异性更强、敏感性更高，该方法专用于立克次氏体精准检测，应用前景广阔。

摘要： 一种双芽巴贝斯虫巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法，本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，本方法检测非常方便快捷，并能提高检测方法的特异性及敏感性，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，针对双芽巴贝斯虫的RAP‑1为靶基因的特异性区域，设计4条特异性引物，解决了现有PCR检测技术在诊断寄生在蜱体内的巴贝斯虫时，牛双芽巴贝斯虫与牛巴贝斯虫之间常出现交叉反应的缺陷，本发明方法反应特异性更强、敏感性更高，该方法专用于牛双芽巴贝斯虫病精准检测，应用前景广阔。

摘要： 一种牛巴贝斯虫巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法，本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，本方法检测非常方便快捷，并能提高检测方法的特异性及敏感性，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，相较于现有的血涂片镜检技术诊断牛巴贝斯虫病，本发明只需采集牛体表寄生的蜱，通过提取蜱的DNA，利用设计的牛巴贝斯虫外引物和内引物，巢式PCR扩增目的基因，可以准确、快速的判断牛是否感染了牛巴贝斯虫。

摘要： 一种蜱虫巢式PCR特异性引物及蜱虫巢式PCR鉴定方法，采用更为敏感的巢式PCR方法，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，通过在基因水平上进行蜱虫的分型、系统进化分析，本发明巢式PCR方法第一轮只需10个循环，第二轮需25个循环，缩短了简单的两轮普通PCR所需时间。

摘要： 本发明涉及病毒基因突变检测技术领域，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR引物及巢式PCR方法，该巢式PCR方法包括如下步骤：以第一对引物对待检测DNA进行第一轮PCR，得到第一轮PCR产物，进行50‑150倍稀释；以第二对引物对第一轮PCR稀释产物进行第二轮PCR，对第二轮PCR产物进行检测。本发明在长期进行HBV研究的基础上，对NCBI上乙肝病毒不同基因型的序列进行比对分析，对相关引物、反应体系进行优化后，探索出的一套特异、准确、操作简便的检测HBV表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR方法，可以用于分析HBV表面抗原免疫逃逸突变以及基因分型，实用性强，符合临床推广的要求。

摘要： 本发明提供了基于一步巢式qPCR法或一步巢式PCR法检测病毒用锁核酸引物及检测试剂盒，属于肠道病毒检测技术领域。所述锁核酸引物包括上游外引物和下游外引物，所述上游外引物和下游外引物中分别标记有2～6个LNA单体。所述锁核酸引物能够与内引物在同一个体系中扩增，且引物长度接近的情况下，实现一步巢式PCR检测，同时，锁核酸引物与常规引物相比，具有较高的检测特异性，有利于提高检测灵敏度。本发明提供了包含锁核酸的试剂盒基于一步巢式qPCR法或一步巢式PCR原理检测病毒。

摘要： 联合多重PCR巢式PCR和降落PCR用于致病性结核分枝杆菌检测的试剂盒。本试剂盒采用多重PCR、巢式PCR和降落PCR联合技术，通过IS6110、IS1081和MPB64三组引物，多重、高效、特异的检测三个分子标志物IS6110、IS1081和MPB64；从而快速诊断致病性结核分枝杆菌，可使测定更为精确。本试剂盒不仅对致病性结核分枝杆菌保守的IS6110、IS1081分子标志物进行检测。同时，对致病结核分枝杆菌野生株中的MPB64分子标志物进行检测，更具有对致病结核分枝杆菌准确的判定意义，可大幅提高对致病性结核分枝杆菌的检出正确率。

摘要： 本发明提供了一种锚定巢式多重PCR联合高通量测序检测基因融合的多重PCR引物，包括多重PCR特异性引物组1和多重PCR特异性引物组2，所述多重PCR特异性引物组1为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列组成的引物组，所述多重PCR特异性引物组2为SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:64所示的核苷酸序列组成的引物组。本发明还提供了一种锚定巢式多重PCR联合高通量测序检测基因融合的多重PCR引物和方法，本发明检测方法通用性更高，本发明检测方法能够在仅部分知晓或未知晓融合基因结构的情况下，准确灵敏地检测融合基因。