食品中细菌数量的快速检测方法和检测试剂盒

摘要

本发明提供了一种食品中细菌数量的快速检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒内包括无菌液体培养基、细菌富集器、细菌显色剂和检测反应空白容器；所述细菌富集器包含纤维分离膜和可拆卸滤头。检测过程为：首先使用纤维分离膜将液体食品或用液体分散的固体食品中的细菌分离富集；然后将纤维分离膜置于检测反应容器中，并向反应容器中加入细菌显色剂进行显色反应2‑4h，通过分光光度计测定显色液的吸光度值，从而得到细菌浓度。本发明通过对纤维分离膜的改进，显著提高了细菌分离富集效率，还可以实现食品中色素的分离，从而提高检测速度和准确度。

说明书

技术领域

本发明涉及食品中微生物检测技术领域，尤其涉及一种食品中细菌数量的快速检测方法和检测试剂盒。

背景技术

食品细菌即指常在食品中存在的细菌，自然界的细菌种类繁多，但由于食品理化性质所处环境条件及加工处理等因素的限制，在食品中存在的细菌只是自然界细菌的一小部分。食品细菌包括致病菌和非致病菌：致病菌是指随食物进入人体后可引起食源性疾病，常见者如沙门氏菌、志贺氏菌等，与疾病的发生直接相关，一般规定在食品中不允许检出；非致病菌一般不会引起人类疾病，但其中一部分为腐败菌，如假单胞菌，与食品变质有密切关系，是评价食品卫生质量的重要指标。

在我国的食品卫生标准中，测定食品中细菌数量的方法，是在严格规定的培养方法和培养条件下进行的，使得适应这些条件的每一个活菌细胞能够生成一个肉眼可见的菌落，所生成的菌落总数即是该食品中的细菌总数。食品中细菌的种类很多，它们的生理特性和所需要的培养条件不尽相同。如果要采用培养的方法计数食品中所有的细菌种类和数量，必须采用不同的培养基及培养条件，其工作量很大，通常会采用检测指标菌的方法来替代。

通过细菌培养检测食品中细菌含量的方法准确率高，但是所需时间过长，无法满足食品领域快速检测的需要。而且在实际生产中，很多食品的保质期也就只有7天，如果检测时间过长，加重了生产成本，生产周期也相应增加，容易导致商品的滞销。

由此可见，当前的食品细菌检测方法并不能很好地满足简便、快速、准确的检测需要，对于难培养、难鉴定的食品源致病菌，需要更高效的检测手段。有鉴于此，有必要设计一种改进的食品中细菌数量的快速检测方法和检测试剂盒，以解决上述问题。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种食品中细菌数量的快速检测方法和检测试剂盒。本发明通过将食品中的细菌富集在分离膜上，同时破坏细菌细胞结构，以使细胞内的脱氢酶释放，然后利用CCK-8检测试剂与脱氢酶的快速显色反应，判断出食品中的细菌含量，分离膜的分离富集效率高，显色反应速度快，因此检测速度快，灵敏度和准确度高。

为实现上述发明目的，本发明提供了一种食品中细菌数量的快速检测方法，包括以下步骤：

S1.用纤维分离膜富集液体食品或固体食品分散液中的细菌；

S2.将富集了所述待检测微生物的纤维分离膜置于空白的无菌反应器中，立即或者培养一定时间后，加入CCK-8显色剂进行显色反应，反应完成后测试吸光度值；

S3.根据吸光度值的高低得到所述菌液中微生物浓度的高低，进而得出所述待检食品中细菌的含量。

作为本发明的进一步改进，在步骤S2中所述的纤维分离膜是由两层纤维膜热压而成，第一层纤维膜表面是由阳离子改性，第二层纤维膜表面是超疏水改性。

作为本发明的进一步改进，第一层是孔径为200-400nm的阳离子改性的纳米纤维膜，所述阳离子改性纤维分离膜的表面改性分子为：

式中，n为4-8的正整数。

作为本发明的进一步改进，所述第二层纤维膜是孔径为15-20um且用氟硅烷进行表面修饰的超疏水微米纤维膜，接触角大于150°。

作为本发明的进一步改进，在步骤S2中，所述显色反应的时间为2-4h，温度为30-40℃。

作为本发明的进一步改进，在步骤S1中，所述检测方法用于发酵食品生产过程中食品内酵母菌的含量检测或者食品出厂时的细菌含量的检测。

作为本发明的进一步改进，在步骤S1中，所述液体食品或固体食品分散液为原始食品试样或者为将原始食品在无菌培养基中培养一定时间后的试样。

作为本发明的进一步改进，在步骤S1中，所述无菌培养基的配制方法包括：将酵母膏和蛋白胨溶于去离子水中，高压和121℃下处理20分钟，然后加入葡萄糖溶液；其中，所述酵母膏的含量为(0.5-1.5)wt％，所述蛋白胨的含量为(1.5-2.5)wt％，所述葡萄糖的含量为(1.5-2.5)wt％；所述原始食品与所述无菌培养基的体积比为1:(50-150)。

一种食品中细菌数量的快速检测试剂盒，包括无菌液体培养基、细菌富集器、细菌显色剂和检测反应空白容器；所述细菌富集器包含以上任一项所述的纤维分离膜和可拆卸滤头。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供的食品中细菌数量的快速检测方法，采用改进的纤维分离膜对食品中的细菌进行过滤富集，然后通过CCK-8进行快速显色反应和吸光度值的检测快速得到细菌浓度。如此操作，直接通过CCK-8检测试剂即可快速获得检测结果，检测的过程简便快捷，耗时短，省去了菌落计数的过程，减少了因菌落计数产生的误差，为食品行业快速检测细菌提供一种快捷的方法。

2.食品中大部分含有色素，对检测会有干扰，本发明对纤维分离膜进行阳离子改性以及者超疏水性质的设计。如此设置，一方面微生物表面带负电荷，阳离子改性后的纳米纤维膜可以通过正负电荷相互作用，主动捕获吸附微生物；另一方面，超疏水的纤维分离膜可以直接把色素过滤下去，避免了色素的干扰，提高检测的准确度。

3.本发明对纤维分离膜的设计，表面阳离子改性的纳米纤维膜可以实现细菌的过滤，但纳米纤维膜也存在易碎等缺陷，因此，第二层超疏水的微米纤维膜不仅可以过滤色素还可以起支撑的作用，有效的解决了色素的干扰以及纳米纤维膜易破的问题。

4.本发明对纤维分离膜的孔径的设计，将微孔结构的拦截效果与阳离子改性对细菌的吸附和杀灭作用进行良好结合，能够显著提高细菌拦截率，并加快脱氢酶的溶出速率，从而提高检测速率和准确度。

附图说明

图1为本发明食品中细菌数量的快速检测方法流程示意图。

图2为细菌富集器的结构示意图。

图3为纤维分离膜的的俯视结构示意图。

图4为纤维分离膜的的层结构示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在具体实施例中仅仅示出了与本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。

另外，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

请参阅图1-4所示，本发明提供的食品中细菌数量的快速检测方法，包括如下步骤：

S1.用纤维分离膜富集液体食品或固体食品分散液中的细菌，例如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌等；可用于发酵食品生产过程中食品内酵母菌的含量检测或者食品出厂时的细菌含量的检测，从而对食品安全进行评价。

在步骤S1中，液体食品或固体食品分散液为原始食品试样或者为将原始食品在无菌培养基中培养9-12h后的试样。当为原始食品试样时，测得的细菌浓度即为食品样品中的真实浓度大小。当为培养后的试样时，可通过细菌浓度大小定性判断出食品中是否含细菌以及细菌含量的相对大小，进行培养的作用是对于食品中细菌含量较低的试样，通过培养可提高试样中细菌的含量，从而提高检测灵敏度。此种方法通过将检测试样的浓度大小与标准培养试样的检测浓度大小进行比较，也可推断出原始细菌含量。

无菌培养基优选为酵母膏胨葡萄糖培养基。所述酵母膏胨葡萄糖培养基包括：将酵母膏和蛋白胨溶于去离子水中，高压和121℃下处理20分钟，然后加入葡萄糖溶液；其中，所述酵母膏的含量为(0.5-1.5)wt％，优选为1wt％；所述蛋白胨的含量为(1.5-2.5)wt％，优选为2wt％；所述葡萄糖的含量为(1.5-2.5)wt％，优选为2wt％。原始食品与所述无菌培养基的体积比为1:(50-150)。

S2.将富集了细菌的纤维分离膜置于空白的无菌反应器中，然后加入CCK-8显色剂(细胞计数试剂，含有WST–8：化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量)进行显色反应2-4h，温度为30-40℃，反应完成后测试波长为450nm处的吸光度值。细菌浓度和吸光度值成正比，可以通过光度值的高低确定细菌浓度。检测原理为：通过将细菌用过滤膜富集后，加入CCK-8溶液，在电子耦合试剂存在的情况下，可被还原成为水溶性的黄色甲瓒产物。活细胞越多，产生的甲瓒就越多，颜色也会越深。反应2h后测450nm处的吸光度值，就可以计算细菌的数量。本发明检测方法操作简便，耗时短，为食品行业快速检测细菌提供一种快捷的方法。

在步骤S2中所述的纤维分离膜是由两层纤维膜热压而成，第一层纤维膜表面是由阳离子改性，第二层纤维膜是超疏水改性。

第一层是孔径为200-400nm的阳离子改性的纳米纤维膜，所述阳离子改性纤维分离膜的表面改性分子为：

式中，n为4-8的正整数。本发明烷基链的长度对富集效果影响显著，烷基链太短，与细菌的反应不够充分；烷基链太长，不利于快速检测，因此，最佳烷基链长度为4-8。

所述第二层纤维膜是孔径为15-20um且用氟硅烷进行表面修饰的超疏水微米纤维膜，接触角大于150°。如图3和4所示，通过两层微米和纳米级纤维膜的复合，过滤富集效果更优。

S3.根据吸光度值的大小得到所述食品中的细菌浓度。

通过采用上述技术方案，本发明的细菌分离富集速率快、富集效果好，显色反应也仅需2h左右，相比现有技术无需长时间培养，检测速率快，显著缩短了食品细菌含量检测时间，对食品行业实现快速检测细菌给予良好的指导作用。

一种食品中细菌数量的快速检测试剂盒，包括无菌液体培养基、细菌富集器、细菌显色剂和检测反应空白容器；细菌富集器包含以上任一项所述的纤维分离膜和可拆卸滤头。其易于拆卸的滤头结构设置有拉环，可直接拉开。该快速检测试剂盒的检测过程为：1)使用细菌富集器分离富集待测样品；2)破除分离器外壳；3)将富集有细菌的分离膜置于空白无菌反应容器中；4)向反应容器中加入细菌显色剂并继续培养2h；5)检测步骤4中液体的吸光度，通过吸光度值高低得到细菌浓度。在此之前，可先制作吸光度值与细菌浓度大小的标准曲线。

实施例1

一种液体食品的细菌含量快速检测方法，包括以下步骤：

S1.用纤维分离膜富集液体食品啤酒等中的细菌；纤维分离膜由阳离子改性的纳米纤维膜和氟硅烷进行表面修饰超疏水结构的微米纤维膜的两层纤维膜热压而成；阳离子改性分子如下：

其中，n为6。

S2.取出富集了细菌的纤维分离膜，放入一个离心管中，同一浓度平行做三组，加入4mL(保证滤膜完全浸入溶液中)CCK-8溶液(用PBS以1:3的比例稀释)，在35.5℃恒温培养箱中反应2h，然后测450nm处的吸光度值；

S3.根据吸光度值的大小得到食品中的细菌含量。

实施例2

一种固体食品的细菌含量快速检测方法，与实施例1相比，不同之处在于，步骤S1包括：将固体食品在水中破碎分散，然后用纤维分离膜富集固体食品中的细菌。其他与实施例1大致相同，在此不再赘述。

实施例3

一种液体食品的细菌含量快速检测方法，与实施例1相比，不同之处在于，步骤S1包括：第一层为阳离子改性的纳米纤维膜、第二层为未进行超疏水结构改性的微米纤维膜热压而成。其他与实施例1大致相同，在此不再赘述。

通过本实施例吸光度值的大小能够判断出液体食品中是否含有细菌，并能定性判断出细菌含量大小。如果液体食品中含有少量细菌，经过培养后细菌数量增多，再进行富集检测时，灵敏度更高，判断准确度更高。克服细菌含量过少时不进行培养直接检测，检测不出的问题。

表1实施例1-3的测试结果

从表1可以看出，双层膜物理结构的设计和化学结构改性设计，有利于提高对待测样品细菌有效富集和有效过滤色素，避免色素对实验的干扰，提高检测的准确率。底层不是超疏水，细菌截留率降低，而且色素残留量高达40％，因此细菌检测偏差率很高，达到了12.6％，对检测结果有很大的干扰。而且采用特殊结构的双季铵盐改性纤维膜，能够有效截留细菌，从而提高富集率，进而提高检测准确率。

综上所述，本发明采用改进的纤维分离膜对食品中的细菌进行过滤富集，然后通过CCK-8进行快速显色反应和吸光度值的检测快速得到细菌浓度。如此操作，直接通过CCK-8检测试剂即可快速获得检测结果，检测的过程简便快捷，耗时短，省去了菌落计数的过程，减少了因菌落计数产生的误差，为食品行业快速检测细菌提供一种快捷的方法。将微孔结构的拦截效果与阳离子对细菌的吸附和杀灭作用以及疏水性对色素的分离进行良好结合，能够显著提高细菌拦截率，并加快脱氢酶的溶出速率，从而提高检测速率和准确度。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。