一株枯草芽孢杆菌BS-15及其制备方法和在诱导植物乳杆菌素EF合成中的应用

摘要

本发明属于微生物技术领域，特别是涉及一株枯草芽孢杆菌BS‑15及其制备方法和在诱导植物乳杆菌素plantaricin EF合成中的应用。本发明提供了一株枯草芽孢杆菌BS‑15，所述枯草芽孢杆菌BS‑15的保藏编号为CGMCC No.20851。本发明提供的枯草芽孢杆菌BS‑15与植物乳杆菌共培养能够有效提高植物乳杆菌分泌的植物乳杆菌素plantaricin EF。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别是涉及一株枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)BS-15及其制备方法和在诱导植物乳杆菌素 plantaricin EF合成中的应用。

背景技术

乳酸菌细菌素是乳酸菌为适应生长条件或环境变化，由核糖体合成后经过加工修饰的具有抑菌活性的蛋白质或多肽，因其可被人胃肠道蛋白酶降解，且具有无抗药性、安全、无毒、无残留等优良特性，成为益生菌活性代谢产物研究与开发的热点。其中，植物乳杆菌素 plantaricin EF属于Ⅱb类细菌素，由两条肽链组成，其具有耐热性， pH耐受性，广谱抗菌性，能够抑制多种病原菌，如单核增生李斯特菌，蜡样芽胞杆菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌；能够抑制其他发酵菌株，如酿酒酵母、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、肠膜明串珠菌。

由于受到培养条件、细菌生长期及自身调控系统影响，植物乳杆菌素plantaricinEF的产生水平往往很低，严重制约其工业化生产及应用。在纯培养条件下，植物乳杆菌素plantaricin EF的产量低，限制了其大规模应用。

目前可用于提高植物乳杆菌素plantaricin EF产量的方法有优化培养基及发酵条件、高效表达合成相关基因、添加诱导物或施加环境条件刺激等。采用发酵条件优化来提高植物乳杆菌素plantaricin EF 产量的效果有限，而且所使用的大部分培养基成本不够经济；利用基因工程技术构建的植物乳杆菌素plantaricin EF异源表达系统，可能会出现植物乳杆菌素plantaricin EF活性低和安全性有待验证等问题；添加诱导物或施加环境条件刺激可利用诱导调控和胁迫应答提高植物乳杆菌素plantaricin EF产量、不涉及安全性问题且成本低廉，被认为是最有应用前景的技术手段。现有技术对经过共培养得到的植物乳杆菌素plantaricin EF产量仍有一定的局限性。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15及其制备方法和在诱导植物乳杆菌素plantaricin EF合成中的应用。本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15 能够有效提高植物乳杆菌分泌植物乳杆菌素plantaricin EF。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的保藏编号为CGMCC No.20851。

本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的培养方法，包括以下步骤：

将上述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15接种于培养基中进行培养得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15。

优选的，所述培养基包括胰蛋白胨大豆肉汤培养基；所述接种的接种量为培养基体积的1％～5％；所述培养的温度为30℃～37℃，培养的时间为18～36h。

本发明提供了上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的菌悬液、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的发酵液或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的分泌物在促进植物乳杆菌分泌植物乳杆菌素plantaricin EF中的应用。

优选的，所述应用包括：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15 和植物乳杆菌共培养。

优选的，所述共培养时，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15 的发酵液的体积与植物乳杆菌的体积比为(1～10):(1～10)。

优选的，所述共培养时，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BS-15的发酵液中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的浓度为 10

优选的，所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)RX-8，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)RX-8 的保藏编号为CGMCC No.20852。

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15，所枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的保藏编号为CGMCC No.20851。本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15与植物乳杆菌共培养能够有效提高植物乳杆菌分泌的植物乳杆菌素plantaricin EF。由实施例可知，通过抑菌圈直径大小对比可知，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) RX-8共培养时，植物乳杆菌素plantaricin EF的合成量在20h左右达到稳定，当合成量达到稳定期时，共培养体系中植物乳杆菌素 plantaricin EF的合成量约是纯培养植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)RX-8的3倍左右。说明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BS-15与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)RX-8共培养不仅可以极大的提高植物乳杆菌素plantaricinEF的产量，还能够缩短4h植物乳杆菌素plantaricin EF的生产时间。

生物保藏说明

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15，于2020年10月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.20851。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)RX-8，，于2020年10 月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏地为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.20852。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的菌落形态；

图2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的菌体细胞；

图3为plnE、plnF基因的电泳图；

图4为纯培养与共培养下植物乳杆菌素plantaricin EF的合成量；

图5为纯培养与共培养过程中植物乳杆菌素plantaricin EF合成量的变化情况；

图6为不同处理条件下枯草芽孢杆菌BS-15的诱导能力检测；

图7为纯培养与共培养过程中植物乳杆菌素plantaricin EF基因 plnE表达量的变化情况；

图8为纯培养与共培养过程中植物乳杆菌素plantaricin EF基因 plnF表达量的变化情况；

图9为对枯草芽孢杆菌BS-15中起诱导作用的物质的研究；

图10为超滤所分离组分的抑菌活性；

图11为超滤所得组分的诱导活性；

图12为凝胶色谱分离情况；

图13为组分A的诱导活性；

图14为组分B的诱导活性；

图15为纯培养与共培养下植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) WCFS1的植物乳杆菌素plantaricin EF的合成量。

具体实施方式

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的保藏编号为CGMCC No.20851。所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BS-15的序列信息如下所示：

CATGGGGGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGG AGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGT GGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGG GCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAA AGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTA GCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAG CCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACG GCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAA TGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAG GTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGC CGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGC CACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCG GTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAG GGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGT GGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGA ACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTG AGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGT AGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTC CGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG GAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGG CCCGCACAGCGGTGGAGCATGTGGTTTATTCGAGCACGCGAGA CCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACATCTAGAGATAGGACGT CCCTTCGGGGCAGAGTGACAGTGTGCATGTGTCGTCAGCTCGT GTCGTGAGATGTGGGTAGTCCCGCACGAGCGCAACCTGATCTA GTTGCAGCATCAGTGGCACTCTTAAGGTGACTTCCGGTGCCAA CCGGAGGAAGGTGGGGGATGGACGTCAATCATCAATGTCCTTAT GACTTGGCCTAACACTGCTTCATATGGGACGAACATAAGGCACG GAACCGCTAGT，SEQ ID NO:1；所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) BS-15的菌落形态如图1所示，菌体细胞照片如图2所示。本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15能够有效提高植物乳杆菌分泌植物乳杆菌素plantaricinEF。

本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的培养方法，包括以下步骤：

将上述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15接种于培养基中进行培养得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15。

在本发明中，所述培养基优选包括胰蛋白胨大豆肉汤培养基 (TSB)；所述接种的接种量优选为培养基体积的1％～5％，进一步优选为1％；所述培养的温度优选为30℃～37℃，进一步优选为37℃，培养的时间优选为18～36h，进一步优选为24h。

本发明提供了上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的菌悬液、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的发酵液或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的分泌物在促进植物乳杆菌分泌植物乳杆菌素plantaricin EF中的应用。在本发明中，所述植物乳杆菌优选为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)RX-8。在本发明中，所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)RX-8的保藏编号为CGMCC No.20852。

在本发明中，当所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的菌悬液和植物乳杆菌进行共培养时，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的菌悬液的体积与植物乳杆菌的质量比优选为(1～10): (1～10)，进一步优选为1:10；所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BS-15菌悬液中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的浓度优选为10

在本发明中，当所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的发酵液和植物乳杆菌共培养时，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BS-15的发酵液的体积与植物乳杆菌的体积比优选为(1～10):(1～10)，进一步优选为10:1；所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BS-15的发酵液中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15的浓度优选为 10

本发明所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15、发酵液和分泌物不仅能有效提高植物乳杆菌分泌植物乳杆菌素plantaricin EF 的产量，还能够加快植物乳杆菌素plantaricin EF的生产时间。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-15及其制备方法和在诱导植物乳杆菌素plantaricin EF合成中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

鉴定植物乳杆菌RX-8所产细菌素为植物乳杆菌素plantaricin EF

将植物乳杆菌RX-8涂布于MRS固体培养基，37℃培养24h。挑取单菌落接种至10mlMRS液体培养基，37℃培养9h，得植物乳杆菌RX-8菌液。按购于天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)说明书方法提取植物乳杆菌RX-8基因组DNA。根据GenBank中Lactobacillus plantarum C11(X94434)和 Lactobacillus plantarum WCFS1(AL935253)已发表的植物乳杆菌素 plantaricin EF基因(plnE和plnF)序列设计引物，引物的序列如表1 所示。

表1 PCR引物

以植物乳杆菌RX-8基因组DNA为模板，采用PCR扩增反应试剂盒进行目的片段的扩增，PCR反应体系如表2所示。PCR反应条件为95℃预变性5min；94℃30s，53℃30s，72℃10s循环30次； 72℃延伸10min，接着4℃保存。取PCR产物4μl，以DL2000为DNA 分子标记，甲基溴酚蓝为染料，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳结果如图3所示。将扩增大小相符的产物寄送至华大基因公司进行测序分析，测序结果与NCBI数据库比对。

表2 PCR反应体系

由图3测序结果比对的结果表明，plnE和plnF基因编码区为 158bp和171bp，与已发表的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum C11 同源性达99.60％和98.67％，可以确定植物乳杆菌RX-8所产细菌素为植物乳杆菌素plantaricin EF。

实施例2

在不同产植物乳杆菌素plantaricin EF培养体系下筛选共培养诱导菌株

(1)制取纯培养与共培养的发酵上清液

将植物乳杆菌RX-8接种至MRS液体培养基，30℃培养24h后得纯培养发酵液。将待筛选的枯草芽孢杆菌从斜面接种到TSB液体培养基中，培养至对数期后以1％接种量转接一代，期间每隔1h测定 OD

将纯培养(植物乳杆菌RX-8)与植物乳杆菌RX-8和上述不同枯草芽孢杆菌共培养发酵液10000r/min离心取上清，用2.5mol/L NaOH调整pH为6.5。在调好pH的发酵上清液中加入溶于磷酸缓冲液的过氧化氢酶，至终浓度5mg/ml，37℃水浴2h后用0.22μm滤膜过滤，得无细胞发酵上清液(cell-free supernatant，CFS)。

(2)植物乳杆菌素plantaricin EF粗提液的制备

采用硫酸铵沉淀法从无细胞发酵上清液中制取纯培养植物乳杆菌素plantaricinEF粗提液。用NaOH调节无细胞发酵上清液(CFS) 的pH至7，再将研磨成粉的硫酸铵缓慢加入，用磁力搅拌器不断搅拌，直到硫酸铵的最终饱和度为80％。置于4℃冰箱中静置沉淀过夜，然后12000r/min 4℃下冷冻离心10min，收集沉淀。将沉淀复溶于 0.02M的Na

(3)测定植物乳杆菌素plantaricin EF粗提液的抑菌活性

首先用移液枪吸取1ml稀释到10

表3不同产植物乳杆菌素plantaricin EF培养体系下共培养诱导菌株的筛选

如表3所示，在不产植物乳杆菌素plantaricin EF培养体系下，只有1株菌能诱导乳杆菌RX-8产植物乳杆菌素plantaricin EF，但未实现植物乳杆菌素plantaricin EF产量从不产到正常产，推测是由于这种不产培养体系的营养物质少，不能满足菌体自身营养供给；在低产植物乳杆菌素plantaricin EF培养体系下，有4株菌显著促进了乳杆菌RX-8植物乳杆菌素plantaricin EF的合成，其中枯草芽孢杆菌 BS-15促进效果最为显著，抑菌直径差达到12mm以上，使植物乳杆菌素plantaricin EF产量从低产到较高产；而在正常产植物乳杆菌素 plantaricin EF培养体系下，虽然这4株试验菌株都有促进效果，但促进效果低于低产培养体系。枯草芽孢杆菌BS-15在此体系下促进效果显著，抑菌直径差达10.55mm。综合以上不同培养体系抑菌直径差的情况，本试验最终选取枯草芽孢杆菌BS-15为最佳共培养菌株、使用低产培养体系作为后续研究的培养条件。

实施例3

检测枯草芽孢杆菌BS-15的诱导能力

在低产培养体系条件下纯培养植物乳杆菌RX-8，以1:1接种比例共培养植物乳杆菌RX-8和枯草芽孢杆菌BS-15，参照实施例2中检测抑菌活性的方法分别检测植物乳杆菌BS-15诱导植物乳杆菌素 plantaricin EF合成能力，检测结果照片见图4。

枯草芽孢杆菌BS-15诱导植物乳杆菌素plantaricin EF高效合成的效果如图4所示，由图4可知，共培养的抑菌圈最大，纯培养枯草芽孢杆菌BS-15没有出现抑菌圈，植物乳杆菌RX-8有抑菌圈但直径远小于共培养的抑菌圈直径。枯草芽孢杆菌BS-15本身对指示菌单核增生李斯特菌无抑制效果，植物乳杆菌RX-8对指示菌有一定抑菌效果，二者共培养后，抑菌圈直径变大，抑菌效果得到明显的增强。

每隔4h取低产培养模型体系下的纯培养和共培养发酵液，参照实施例2的方法分别检测枯草芽孢杆菌BS-15诱导植物乳杆菌素 plantaricin EF合成能力，检测结果见图5和表4。

表4草芽孢杆菌BS-15诱导植物乳杆菌素plantaricin EF合成能力

如图5和表4所示，4h时共培养体系中就产生少量植物乳杆菌素plantaricin EF，但纯培养体系还尚未合成植物乳杆菌素plantaricin EF。两种培养体系下，植物乳杆菌素plantaricin EF的合成量变化趋势大致相同，合成量均在20h左右达到稳定，32h左右开始减少。但当达到稳定期时，共培养体系中植物乳杆菌素plantaricin EF的合成量约是纯培养的3倍。而且诱导菌不仅可以极大的提高植物乳杆菌素 plantaricin EF产量，还可以把开始产植物乳杆菌素plantaricin EF的时间提前4h。

实施例4

检测不同处理条件下枯草芽孢杆菌BS-15的诱导能力

将枯草芽孢杆菌BS-15进行如下处理：

a.将枯草芽孢杆菌BS-15纯培养发酵液10000r/min离心后弃上清，然后用生理盐水清洗3遍，即得菌悬液；

b.用0.22μm细菌过滤膜处理发酵上清液，得无菌发酵上清液；

c.用Trans-Well.分隔两种菌，使二者无法直接接触但可以自由交换代谢物质，使两种菌在低产培养体系下间接共培养。

将a和b处理所得与植物乳杆菌RX-8在低产培养体系下直接共培养。以植物乳杆菌RX-8纯培养发酵液为对照。

将培养后的不同处理组与对照组的发酵液参照实施例2的方法，检测不同处理条件下枯草芽孢杆菌BS-15的诱导能力，结果如图6 和表5所示。

表5不同处理条件下枯草芽孢杆菌BS-15的诱导能力

如图6和表5所示，枯草芽孢杆菌BS-15的菌悬液、发酵液和其代谢物菌都能够诱导植物乳杆菌素plantaricin EF的高效合成。

实施例5

纯培养和共培养中植物乳杆菌素plantaricin EF基因plnE、plnF 表达量的变化情况

每隔4h取纯培养和共培养的发酵液，10000r/min离心弃上清保留菌体。依据购自与天根生化科技有限公司的RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit RNA提取试剂盒说明书操作，提取植物乳杆菌RX-8 总RNA。采用天根FastQuant cDNA第一链合成试剂盒，将植物乳杆菌RX-8的RNA反转录为cDNA。采用购自与天根生化科技有限公司的SuperReal荧光定量预混合试剂增强版(SYBR Green)试剂盒进行RT-qPCR，所用引物用表6所示，反应体系如表7所示，反应条件为：95℃2min；94℃20s，63℃45s，循环39次；60℃5min；以16S 基因作为内参，以空白实验组作对照，同时采用2

表6 RT-qRCR引物

表7 RT-qRCR反应体系

表8纯培养和共培养中植物乳杆菌素plantaricin EF基因plnE表达量的变化情况

表9纯培养和共培养中植物乳杆菌素plantaricin EF基因plnF表达量的变化情况

如图7、图8和表8、表9所示，8h后共培养体系中plnEF基因的转录水平较纯培养都大幅度提高，当最终到达发酵稳定期时，共培养后的plnE和plnF基因的表达量较纯培养时提高了8.3倍。结合图 5与图7、图8，共培养下植物乳杆菌素plantaricin EF与plnE和plnF基因表达量的变化趋势一致，而纯培养下，植物乳杆菌素plantaricin EF的表达量几乎不随培养时间变化；说明枯草芽孢杆菌BS-15可产生诱导物，通过诱导plnE和plnF基因的表达来提高植物乳杆菌素 plantaricin EF的产量。

实施例6

枯草芽孢杆菌BS-15中起诱导作用的物质

将枯草芽孢杆菌BS-15进行如下处理：

a.将枯草芽孢杆菌BS-15纯培养发酵液10000r/min离心后弃上清，然后用生理盐水清洗3遍，即得菌悬液；

b.在a处理的基础上121℃灭活15min，得灭活菌悬液；

c.用0.22μm细菌过滤膜处理发酵上清液，得无菌发酵上清液；

d.在c处理基础上，在无菌发酵上清中加入2mg/ml的蛋白酶K 在pH 8.0下37℃孵育2h，再80℃加热15min灭活酶，即得酶解无菌发酵上清；

将a～d处理所得与植物乳杆菌RX-8在低产培养体系下直接共培养。以植物乳杆菌RX-8纯培养发酵液为对照。

将培养后的不同处理组与对照组的发酵液参照实施例2的方法，检测不同处理条件下枯草芽孢杆菌BS-15的诱导能力，结果如图9 和表10所示。

表10不同处理条件下枯草芽孢杆菌BS-15的诱导能力

由图9和表10可知，与纯培养乳杆菌RX-8相比，只有枯草芽孢杆菌BS-15的上清液和菌体自身诱导了乳杆菌RX-8产生植物乳杆菌素plantaricin EF，经过蛋白酶处理和高压高温处理后的枯草芽孢杆菌BS-15无诱导作用，说明诱导物质是活细胞产生的蛋白类物质。

实施例7

枯草芽孢杆菌BS-15中起诱导作用的有效组分的分离

取植物乳杆菌素plantaricin EF粗提液，用0.22μm滤膜过滤后，加到5000Da超滤管中，6000r/min离心15min。大于5000Da的组分被超滤管截流，设为组分1，小于5000Da的组分可通过超滤管，设为组分2。收集组分1与2，参考实施例2的方法验证两种组分的抑菌活性和诱导活性。结果如图10、图11和表11所示。

由图10可知，分子量大于5000Da的组分1能够检测到抑菌活性；而分子量小于5000Da的组分2只检测到无抑菌活性，这与植物乳杆菌素plantaricin EF的两个肽段，plnE的分子量6191Da，plnF的分子量5733Da的结果一致。

由图11可知，组分1和组分2都可以检测到诱导活性，但组分 2的诱导活性远大于组分1。图10和图11共同表明，植物乳杆菌素 plantaricin EF存在于组分1，起诱导作用的组分大量存在于分子量小于5000Da的组分2中。

表11组分1与2诱导性的验证

通过凝胶色谱柱Sephadex G-25继续分离组分2，具体操作如下：

1)Sephadex G25的预处理：将适量的Sephadex G-25粉末置于一定量的超纯水中，在浸泡初期每隔一段时间进行搅拌，使Sephadex G25粉末充分吸水溶胀，浸泡过夜。

2)装柱：采用的玻璃珠的规格为1.6cm×60cm，在进行填料的填充之前，使用流动相对其进行清洗并检测玻璃柱的上下两端是否存在漏液现象。如果漏液检测正常，开始填料的填充。使玻璃柱下端的管道处于畅通状态，采用玻璃棒进行引，小心将充分溶胀之后Sephadex G-25倒入到玻璃柱中，待液面达到快要溢出时停止加液，待玻璃柱中的液面下降之后继续加入Sephadex G-25溶液，最终是Sephadex G-25填料填充整个玻璃柱。在填料期间需要注意的是，避免气泡的产生，如果产生了气泡可以用玻璃棒缓慢将其排除，否则只能重新填充。

3)平衡：蛋白质纯化仪AKTA pure参数为总流速1mL/min，泵 B流速1mL/min，平衡30min；

4)除杂：玻璃柱平衡之后，采用0.2M NaOH清洗玻璃柱，直到 220nm处的吸收值在同一水平值，然后采用超纯水将0.2M NaOH洗净，再接入20mM磷酸盐缓冲液，待磷酸盐缓冲液彻底充满玻璃柱，且紫外吸收值稳定后，准备上样。

5)上样：点击蛋白质纯化仪AKTA pure手动进样，然后采用进样器注入1mL组分2，点击完成进样。

6)洗脱：洗脱流速为1mL/min，洗脱溶液20mM磷酸盐缓冲液，线性洗脱。

7)收集：实时在线检测紫外吸收峰，根据峰形收集组分。

8)组分验证：将洗脱后的洗脱峰用真空浓缩仪浓缩，参照实施例2进行诱导验证试验(其中对照组使用的是植物乳杆菌RX-8纯培养发酵液)，结果如图12、图13、图14和表12所示。其中图12为凝胶色谱分离情况。由图12可知，220nm波长下出现两个峰，代表两种不同的组分，分别命名为组分A和组分B。

图13为组分A的诱导活性，图14为组分B的诱导活性。

表12组分A与B诱导性的验证

由图13和表12可知，组分A无诱导能力；由图14和表12可知，组分B有显著诱导能力，表明起到诱导效应的组分位于组分B 中。

实施例8

将植物乳杆菌WCFS1接种至MRS液体培养基，30℃培养24h 后得纯培养发酵液。在正常培养模型体系下，向植物乳杆菌WCFS1 发酵液中加入实施例7所得到的组分B进行共同发酵，接种体积比例为1:10，培养24h得共培养发酵液。参照实施例2的方法检测抑菌活性，结果如图15和表14所示。

表14枯草芽孢杆菌BS-15诱导植物乳杆菌WCFS1生成植物乳杆菌素plantaricinEF的能力

由图15和表14可知，枯草芽孢杆菌BS-15的分泌物不仅能够诱导植物乳杆菌RX-8合成分泌植物乳杆菌素plantaricin EF，还可以诱导植物乳杆菌WCFS1合成分泌植物乳杆菌素plantaricin EF。其中植物乳杆菌WCFS1是一株经过广泛研究的产植物乳杆菌素plantaricin EF的典型菌株，来自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)，编号为ATCC BAA-793，是其他产植物乳杆菌素plantaricin EF的植物乳杆菌的参照菌株，具有很好的代表性。由上述内容可知，本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BS-15具有诱导植物乳杆菌合成分泌植物乳杆菌素plantaricin EF的能力。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 北京工商大学

<120> 一株枯草芽孢杆菌BS-15及其制备方法和在诱导植物乳杆菌素EF合成中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1214

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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