用于治疗肌营养不良的肌肉特异性微小肌营养不良蛋白的腺相关病毒载体递送

摘要

本发明提供了表达微型化的人微小肌营养不良蛋白基因的基因治疗载体，诸如腺相关病毒(AAV)载体，以及使用这些载体在包括隔膜肌和心肌在内的骨骼肌中表达微小肌营养不良蛋白以及使肌纤维免受损伤、增加肌肉力量以及减少和/或预防患有肌营养不良的受试者的纤维化的方法。

说明书

本申请要求2018年6月18日提交的美国临时专利申请号 62/686,668号；2018年10月2日提交的美国临时专利申请号 62/740,402；2018年10月30日提交的美国临时专利申请号 62/752,841；2019年3月25日提交的美国临时专利申请号 62/823,649和2018年6月11日提交的美国临时专利申请号 62/860,220的优先权权益，这些临时专利申请中的每个以引用的方 式整体并入本文。

以引用的方式并入以电子方式提交的材料

作为本公开的单独部分，本申请含有计算机可读形式的序列表， 该序列表以引用的方式整体并入本文并且标识如下：文件名： 53169_Seqlisting.txt；大小：60,056字节，创建日期：2019年6月17 日。

技术领域

本发明提供了表达微型化的人微小肌营养不良蛋白基因的基因 治疗载体，诸如腺相关病毒(AAV)载体，以及使用这些载体在包 括隔膜肌和心肌在内的骨骼肌中表达微小肌营养不良蛋白以及使肌 纤维免受损伤、增加肌肉力量以及减少和/或预防患有肌营养不良的 受试者的纤维化的方法。

背景技术

肌肉质量和力量对于日常活动(诸如运动和呼吸)以及全身代 谢的重要性是显而易见的。肌肉功能不足会引起肌营养不良(MD) (所述肌营养不良的特征在于肌无力和消瘦)并且会严重影响生活 质量。最完善表征的MD是编码肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(DAPC)的成员的基因突变的结果。这些MD是DAPC引起的肌 膜细胞骨架栓系丧失相关的膜脆性的结果。杜兴肌营养不良(DMD) 是最致命的肌肉疾病之一，在5000名新生男孩中就有1名受其影响。

DMD是由DMD基因中的突变导致的，所述突变导mRNA的减 少和肌营养不良蛋白的缺失，肌营养不良蛋白是一种与肌营养不良 蛋白相关蛋白复合物(DAPC)相关的427kD肌膜蛋白(Hoffman等 人,Cell 51(6):919-28,1987)。DAPC由肌肉肌膜处的多种蛋白质组 成，这些蛋白质经由肌营养不良蛋白(一种肌动蛋白结合蛋白)和 α-肌营养不良蛋白聚糖(一种层粘连蛋白结合蛋白)在胞外基质 (ECM)和细胞骨架之间形成结构连接。这些结构连接用于在收缩 过程中稳定肌肉细胞膜以及防止收缩引起的损伤。随着肌营养不良 蛋白的丧失，膜脆性导致肌膜撕裂和钙内流，从而触发钙活化的蛋 白酶和分段性纤维坏死(Straub等人,Curr Opin.Neurol.10(2):168- 75,1997)。肌肉退化和再生的这种不受控制的循环最终会耗尽肌肉 干细胞群(Sacco等人,Cell,2010.143(7):第1059-71页；Wallace等 人,Annu Rev Physiol,2009.71:第37-57页)，从而引起进行性肌无 力、肌内膜炎症和纤维化瘢痕。

在不存在来自肌营养不良蛋白或微小肌营养不良蛋白的膜稳定 的情况下，DMD将表现出组织损伤的不受控制的循环，并且通过结 缔组织增殖来进行纤维化瘢痕组织替代丧失的肌纤维的最终修复。 纤维化的特征在于ECM基质蛋白(包括胶原蛋白和弹性蛋白)的过 多沉积。ECM蛋白主要由细胞因子(诸如TGF)产生，所述细胞 因子由活化的成纤维细胞响应于应激和炎症而释放。虽然DMD的 主要病理特征是肌纤维退化和坏死，但是作为病理结果的纤维化具 有相同的后果。纤维化组织的过度产生限制了肌肉再生，并且导致 了DMD患者的进行性肌无力。在一项研究中，初始DMD肌肉活检 中纤维化的存在与10年随访的不良运动结局高度相关联(Desguerre 等人,J Neuropathol Exp Neurol,2009.68(7):第762-7页)。这些结果 表明纤维化是导致DMD肌肉功能障碍的主要因素，并且强调了在 明显纤维化之前需要早期干预的必要性。

对于患有DMD的患者，需要增加肌肉力量以及防止肌肉损的 治疗。

发明内容

本发明涉及将微小肌营养不良蛋白基因表达至骨骼肌(包括隔 膜肌和心肌)，以使肌纤维免受损伤、增加肌肉力量以及减少和/或 预防纤维化的基因治疗载体，例如AAV。

本发明提供了用于使用基因治疗载体来递送微小肌营养不良蛋 白，以解决在DMD中观察到的基因缺陷，从而增加肌肉力量和/或 增加肌肉质量的疗法和方法。实施例2描述了针对杜兴肌营养不良 的全身性基因递送临床试验，在该研究中，受试者接受2×1014vg/kg AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白。实施例3中描述的临 床研究提供了一种新型关键性临床方案，所述方案包括随机双盲安 慰剂对照设计。在研究开始时，受试者被随机分组并且接受2×10

本发明提供了包含SEQ ID NO:3、8或9的核苷酸序列的核酸 分子。本发明还提供了包含SEQ ID NO:9的核酸序列或SEQ ID NO: 8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021的rAAV，以 及包含SEQ ID NO:9的核酸序列或SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977 或SEQID NO:3的核苷酸55-5021的rAAV颗粒。

本发明的另一个方面提供了包含核酸分子、rAAV和rAAV颗粒 的组合物，所述核酸分子包含SEQ ID NO:3、8或9的核苷酸序列， 所述rAAV包含SEQ ID NO:9的核酸序列或SEQID NO:8的核苷 酸1-4977或SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021，所述rAAV颗粒包含 SEQ IDNO:9的核酸序列或SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021。本文公开的任何方法都可以使用这些组 合物进行。

本发明提供了治疗有需要的人受试者的肌营养不良的方法，所 述方法包括施用重组腺病毒(rAAV)相关rAAV.MHCK7.微小肌营 养不良蛋白的步骤，其中所述rAAV以5.0×10

例如，所施用的rAAV的剂量为约5.0x10

在一个实施方案中，本发明的方法包括全身性施用rAAV，其 中所述全身性施用途径是静脉内途径，并且所施用的rAAV的剂量 为约2.0×10

在本发明的方法中的任一者中，rAAV的剂量可以以约5mL/kg 至约15mL/kg、或约8mL/kg至约12mL/kg、或8mL/kg至约 10mL/kg、或5mL/kg至约10mL/kg、或约10mL/kg至12mL/k、或 约10mL/kg至15mL/kg、或10mL/kg至约20mL/kg施用。在一个特 定实施方案中，剂量或rAAV以约10mL/kg施用。在一个实施方案 中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白或 AAVrh74.MCK.微小肌营养不良蛋白。在一个实施方案中，rAAV是 SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022。在一个实施方案中，rAAV是SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌营养不良蛋白。

在本发明的方法中的任一者中，rAAV的剂量可以通过注射、 输注或移植来施用。例如，rAAV的剂量通过经大约一小时的输注 来施用。此外，rAAV的剂量通过外周肢静脉(诸如，外周臂静脉 或外周腿静脉)的静脉内途径来施用。或者，输注可以经大约30分 钟、或大约1.5小时、或大约2小时、或大约2.5小时、或大约3小 时施用。在一个实施方案中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小肌营 养不良蛋白。在一个实施方案中，AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白、 SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、 或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022。在一个实施方案中，rAAV是 AAVrh74.MCK.微小肌营养不良蛋白。在一个实施方案中， AAVrh74.MCK.微小肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:5的核苷酸56- 4820的AAVrh74.MCK.微小肌营养不良蛋白。

通过本发明的方法中的任一者施用的rAAV可以包含SEQ ID NO:1的人微小肌营养不良蛋白核苷酸序列，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列。此外，通过本发明的方法中的任 一者施用的rAAV包含SEQ ID NO:1的人微小肌营养不良蛋白核苷 酸序列和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列。 例如，rAAV可以包含SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营 养不良蛋白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022。 在一个实施方案中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋 白。在一个实施方案中，AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白是 SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022。

在一个实施方案中，rAAV是AAVrh74.MCK.微小肌营养不良 蛋白。在一个实施方案中，AAVrh74.MCK.微小肌营养不良蛋白是 SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌营养不良 蛋白。

在本发明的方法中的任一者中，所施用的rAAV是血清型 AAVrh7.4的。

在一些实施方案中，本发明的方法治疗杜兴肌营养不良或贝克 尔肌营养不良。一个示例性实施方案是一种治疗有需要的人受试者 的杜兴肌营养不良或贝克尔肌营养不良的方法，所述方法包括施用 剂量重组腺病毒(rAAV)相关rAAV.MHCK7.微小肌营养不良蛋白的步骤，其中施用途径是静脉内输注，并且所施用的rAAV的剂量 为经大约一小时约2×10

在一个实施方案中，本发明提供了rAAV，所述rAAV包含肌 肉特异性控制元件核苷酸序列和编码微小肌营养不良蛋白的核苷酸 序列。例如，核苷酸序列编码功能性微小肌营养不良蛋白，其中所 述核苷酸与SEQ ID NO:1具有例如至少65％、至少70％、至少75％、 至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或 89％、更通常地至少90％、91％、92％、93％或94％、甚至更通常地 至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，其中所 述蛋白质保持了微小肌营养不良蛋白活性。微小肌营养不良蛋白在 肌肉收缩期间为肌肉膜提供稳定性，例如，微小肌营养不良蛋白在 肌肉收缩期间作为减震器。在一个实施方案中，rAAV是 AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白。在一个实施方案中，AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:9的 AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白、或SEQ ID NO:3的核苷酸 55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷 酸56-5022。在一个实施方案中，rAAV是AAVrh74.MCK.微小肌营 养不良蛋白。在一个实施方案中，AAVrh74.MCK.微小肌营养不良 蛋白是SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌营 养不良蛋白。

本发明还提供了rAAV，其中所述核苷酸序列包括在严格条件 下与SEQ ID NO:1或其互补序列的核酸序列杂交，并且编码功能性 微小肌营养不良蛋白的核苷酸序列。

在一个实施方案中，rAAV是非复制性重组腺相关病毒 (AAV)，即SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良 蛋白、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1- 4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022。该载体基因组包含基因 表达所需的最小元件，包括AAV2反向末端重复序列(ITR)、微 小肌营养不良蛋白、SV40内含子(SD/SA)和合成多腺苷酸化(多 聚A)信号，所有这些元件均在MHCK7启动子/增强子的控制下。 载体基因组和表达盒的示意图如图1所示。在静脉内施用后， AAVrh74血清型可以用于在骨骼肌和心肌中实现有效的基因转移。

术语“严格”用于指在本领域中通常理解为严格的条件。杂交严 格性主要通过温度、离子强度和变性剂(诸如甲酰胺)的浓度来确 定。用于杂交和洗涤的严格条件的实例是在65-68℃下的0.015M氯 化钠、0.0015M柠檬酸钠或者在42℃下的0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺。参见Sambrook等人,

为了减少非特异性和/或背景杂交，可以在杂交和洗涤缓冲液中 包含其他试剂。实例是0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、 0.1％焦磷酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠、NaDodSO4、(SDS)、 ficoll、登哈特(Denhardt)溶液、超声处理的鲑鱼精子DNA(或其他非互补性DNA)和硫酸葡聚糖，虽然还可以使用其他合适的试剂。 可以改变这些添加剂的浓度和类型，而基本上不影响杂交条件的严 格性。杂交实验通常在pH6.8-7.4下进行，然而，在典型的离子强度 条件下，杂交的速率几乎与pH无关。参见Anderson等人,

术语“肌肉特异性控制元件”是指调节对于在肌肉组织中的表达 具有特异性的编码序列的表达的核苷酸序列。这些控制元件包括增 强子和启动子。本发明提供了包含肌肉特异性控制元件MCKH7启 动子、MCK启动子和MCK增强子的构建体。

术语“可操作地连接”是指调控元件核苷酸序列(例如启动子核 苷酸序列)的定位，以通过所述调控元件赋予所述核苷酸序列的表 达。

在一个方面，本发明提供了rAAV，其中肌肉特异性控制元件 是人骨骼肌肌动蛋白基因元件、心肌肌动蛋白基因元件、肌细胞特 异性增强子结合因子(MEF)、肌肉肌酸激酶(MCK)、截短的 MCK(tMCK)、肌球蛋白重链(MHC)、杂合体α-肌球蛋白重链 增强子/MCK增强子-启动子(MHCK7)、C5-12、鼠科动物肌酸激 酶增强子元件、骨骼肌快缩肌钙蛋白c基因元件、慢缩心肌肌钙蛋 白c基因元件、慢缩肌钙蛋白i基因元件、缺氧诱导性核因子、类固 醇诱导性元件或糖皮质激素应答元件(GRE)。

例如，肌肉特异性控制元件是MHCK7启动子核苷酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7，或者肌肉特异性控制元件是MCK核苷 酸序列SEQ ID NO:4。此外，在本发明的rAAV载体中的任一者中， 肌肉特异性控制元件核苷酸序列(例如MHCK7或MCK核苷酸序 列)可操作地连接至编码微小肌营养不良蛋白的核苷酸序列。例如， MHCK7启动子核苷酸序列(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7)可操 作地连接至人微小肌营养不良蛋白编码序列(SEQ ID NO:1)，如 图1或图2(SEQ ID NO:3)或图13(SEQ ID NO:9)中提供的构 建体所示。在另一个实例中，MCK启动子(SEQ ID NO:4)可操作 地连接至人微小肌营养不良蛋白编码序列(SEQ ID NO:1)，如图5 或图6(SEQ ID NO:5)提供的构建体所示。在另一个方面，本发明 提供了rAAV载体，所述rAAV载体包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2或者SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7的核苷酸序列。本发明还 提供了rAAV载体，所述rAAV载体包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

在另一个方面，本发明提供了包含在质粒中的rAAV构建体， 所述质粒包含SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的核苷酸序列。例如，AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良 蛋白载体包含这样的核苷酸序列：所述核苷酸序列在SEQ ID NO:3 的ITR内并且包括末端，如图2所示。rAAV载体包含5'ITR、 MHCK7启动子、嵌合内含子序列、人微小肌营养不良蛋白基因的 编码序列、多聚A和3'ITR。在一个实施方案中，载体包含SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021。SEQ ID NO:3所示的质粒还包含氨苄青霉 素抗性和具有pBR322复制起点的pGEX质粒骨架。

在另一个方面，本发明提供了包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列 的rAAV。例如，AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白载体构建 体包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列，如图13所示。该rAAV载体 构建体包含MHCK7启动子、嵌合内含子序列、人微小肌营养不良 蛋白基因的编码序列和多聚A。在一个实施方案中，rAAV载体构建 体还包含启动子的5'的ITR和多聚A的3'的ITR。在一个实施方案 中，rAAV是AAVrh74。

在另一个方面，AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白载体包 含这样的核苷酸序列：所述核苷酸序列在SEQ ID NO:8的ITR内并 且包括末端，如图15所示。rAAV载体包含5'ITR、MHCK7启动子、 嵌合内含子序列、人微小肌营养不良蛋白基因的编码序列、多聚A 和3'ITR。在一个实施方案中，载体包含SEQ ID NO:9的核苷酸1- 4977。SEQ ID NO:3所示的质粒还包含卡那霉素抗性和具有 pBR322复制起点的pGEX质粒骨架。

在另一个方面，本发明提供了包含AAVrh74.MHCK7.微小肌营 养不良蛋白载体构建体的质粒。在一个实施方案中，质粒包含5' ITR、MHCK7启动子、嵌合内含子序列、人微小肌营养不良蛋白基 因的编码序列、多聚A和3'ITR。在一个实施方案中，质粒包含卡 那霉素抗性并且任选地包含具有pBR322复制起点的pGEX质粒骨 架。在一个特定的实施方案中，质粒如SEQ ID NO:8所示，并且在 图14和15中显示。

本发明提供了重组AAV载体，所述重组AAV载体包含SEQ ID NO:1的人微小肌营养不良蛋白核苷酸序列和SEQ ID NO:2或 SEQ ID NO:7的MHCK7启动子核苷酸序列。该rAAV载体是AAV 血清型AAVrh.74。

本发明还提供了rAAV，所述rAAV包含在SEQ ID NO:3中的 ITR内并且包括末端的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建 体核苷酸序列、在SEQ ID NO:8中的ITR内并且包括末端的核苷酸 序列或如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。该rAAV载体是AAV 血清型AAVrh.74。

本发明的rAAV载体可以是任何AAV血清型，诸如血清型 AAVrh.74、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13。

本发明还提供了包含本发明的rAAV载体中的任一者的药物组 合物(或者有时在本文中简称为“组合物”)。

在另一个实施方案中，本发明提供了产生rAAV载体颗粒的方 法，所述方法包括培养已经用本发明的任何rAAV载体转染的细胞， 以及从所转染的细胞的上清液回收rAAV颗粒。本发明还提供了包 含本发明的重组AAV载体中的任一者的病毒颗粒。

在治疗肌营养不良的方法中的任一者中，在施用rAAV后，受 试者的细胞中的微小肌营养不良蛋白基因表达的水平增加。在施用 rAAV之前和之后，通过活检肌肉中的蛋白质印迹来测量微小肌营 养不良蛋白水平，从而检测微小肌营养不良蛋白基因在细胞中的表达。具体而言，与施用rAAV前的微小肌营养不良蛋白的水平相比， 在施用rAAV后，微小肌营养不良蛋白的水平增加至少约70％至至 少约80％、或至少约70％至至少约90％、或至少约80％至至少约 90％。例如，与施用rAAV前的微小肌营养不良蛋白的水平相比， 在施用rAAV后，微小肌营养不良蛋白的水平增加至少约70％、或 至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至 少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约 83％、或至少约84％、或至少约85％。

此外，通过在施用rAAV之前和之后肌肉活检中的免疫组织化 学来测量微小肌营养不良蛋白水平，从而检测微小肌营养不良蛋白 基因在细胞中的表达。与施用rAAV前的微小肌营养不良蛋白的水 平相比，在施用rAAV后，微小肌营养不良蛋白的水平增加至少约70％至至少约80％、或至少约70％至至少约90％、或至少约80％至 至少约90％。例如，与施用rAAV前的微小肌营养不良蛋白的水平 相比，在施用rAAV后，微小肌营养不良蛋白的水平增加至少约 70％、或至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约 74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约 78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约 82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％。

在治疗肌营养不良的方法中的任一者中，与施用rAAV前的血 清CK水平相比，在施用rAAV后，受试者的血清CK水平降低。例 如，与施用rAAV前的血清CK水平相比，在施用rAAV后60天， 受试者的血清CK水平降低约65％至约90％、或约65％至约95％、 或约75％至约90％、或约80％至约90％、或约85％至约95％、或约 87％至约95％、或约87％至约90％。具体而言，在本发明的治疗肌 营养不良的方法中的任一者中，与施用rAAV前的血清CK水平相比，在施用rAAV后60天，受试者的血清CK水平降低约87％，或 者在本发明的治疗肌营养不良的方法中的任一者中，与施用rAAV 前的血清CK水平相比，在施用rAAV后60天，受试者的血清CK 水平降低约72％，或者在本发明的治疗肌营养不良的方法中的任一 者中，与施用rAAV前的血清CK水平相比，在施用rAAV后60天， 受试者的血清CK水平降低约73％，或者在本发明的治疗肌营养不 良的方法中的任一者中，与施用rAAV前的血清CK水平相比，在 施用rAAV后60天，受试者的血清CK水平降低约78％，或者在本 发明的治疗肌营养不良的方法中的任一者中，与施用rAAV前的血 清CK水平相比，在施用rAAV后60天，受试者的血清CK水平降 低约95％。在治疗肌营养不良的方法中的任一者中，与施用rAAV 前的微小肌营养不良蛋白阳性纤维的数量相比，在施用rAAV后， 受试者的肌肉组织中的微小肌营养不良蛋白阳性纤维的数量增加。 例如，在施用rAAV之前和之后，通过针对肌肉活检的蛋白质印迹 或免疫组织化学来测量微小肌营养不良蛋白水平，从而检测微小肌 营养不良蛋白阳性纤维的数量。

在治疗肌营养不良的方法中的任一者中，rAAV的施用使DAPC 蛋白(诸如α-肌聚糖或β-肌聚糖)的表达上调。例如，与施用 rAAV前的α-肌聚糖的水平相比，在施用rAAV后，受试者中的α- 肌聚糖的水平增加。此外，与施用rAAV前的β-肌聚糖的水平相比， 在施用rAAV后，受试者中的β-肌聚糖的水平增加。在施用rAAV 之前和之后，通过针对肌肉活检的蛋白质印迹或免疫组织化学来测 量α-肌聚糖或β-肌聚糖蛋白水平，从而检测α-肌聚糖或β-肌聚糖的 水平。

在治疗肌营养不良的方法中的任一者中，在施用rAAV后，受 试者的疾病进展延迟，如通过以下测试中的任一者来测量：六分钟 步行测试、起立时间、上升4梯、上升和下降4梯、北极星移动评 估量表(NSAA)、10米计时测试、100米计时测试、手持式肌力测 定(HHD)、计时起立-行走和/或大幅运动子测试量表(Bayley-III) 分数。

例如，在任何方法中，与施用rAAV前的NSAA得分相比，在 施用rAAV后至少270天，受试者的NSAA得分具有至少6分的改 善。此外，在任何方法中，与施用rAAV前的起立时间相比，在施 用rAAV后至少270天，受试者的起立时间具有至少约0.8秒的改善。 此外，在任何方法中，与施用rAAV前的上升4梯的时间测试相比， 在施用rAAV后至少270天，受试者的上升4梯的时间测试具有至 少约1.2秒的改善。此外，在任何方法中，与施用rAAV前的100m 计时测试相比，在施用rAAV后至少270天，受试者的100m计时测 试具有至少约7秒的改善。

在另一个实施方案中，本发明提供了在患者细胞中表达微小肌 营养不良蛋白基因的方法，所述方法包括将SEQ ID NO:9的 AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022施用于所述患者。例如，在施用 rAAV.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体之前和之后，通过肌肉活 检中的蛋白质印迹或免疫组织化学来测量微小肌营养不良蛋白水平， 从而检测微小肌营养不良蛋白基因在患者细胞中的表达。此外，通 过检测更多的每个细胞核的载体基因组的数量来测量患者中的微小 肌营养不良蛋白基因的表达，其中每个细胞核1个载体基因组为约 50％的微小肌营养不良蛋白表达，并且每个细胞核大于1个拷贝与 微小肌营养不良蛋白表达水平一致。例如，细胞具有每个细胞核1.2 个载体拷贝、或每个细胞核1.3个载体拷贝、或每个细胞核1.4个载 体拷贝、或每个细胞核1.5个载体拷贝、或每个细胞核1.6个载体拷 贝、或每个细胞核1.7个载体拷贝、或每个细胞核1.8个载体拷贝、 或每个细胞核1.9个载体拷贝。

在另一个实施方案中，本发明提供了减少有需要的患者的血清 CK水平的方法，所述方法包括将SEQ ID NO:9的 AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022施用于所述患者。例如，与施用rAAV 前的血清CK水平相比，在施用rAAV后60天，患者中的血清CK 水平降低至少约65％至约90％、或约65％至约95％、或约75％至约 90％、或约80％至约90％、或约85％至约95％、或约87％至约95％、 或约87％至约90％。具体而言，与施用rAAV前的血清CK水平相 比，在施用rAAV后60天，受试者的血清CK水平降低约87％，或者在本发明的治疗肌营养不良的方法中的任一者中，与施用rAAV 前的血清CK水平相比，在施用rAAV后60天，受试者的血清CK 水平降低约72％，或者在本发明的治疗肌营养不良的方法中的任一 者中，与施用rAAV前的血清CK水平相比，在施用rAAV后60天， 受试者的血清CK水平降低约73％，或者在本发明的治疗肌营养不 良的方法中的任一者中，与施用rAAV前的血清CK水平相比，在 施用rAAV后60天，受试者的血清CK水平降低约78％，或者在本 发明的治疗肌营养不良的方法中的任一者中，与施用rAAV前的血 清CK水平相比，在施用rAAV后60天，受试者的血清CK水平降 低约95％。

本发明还提供了增加患者肌肉组织中的微小肌营养不良蛋白阳 性纤维的方法，所述方法包括将SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7. 微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸 55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷 酸56-5022施用于所述患者。例如，在施用rAAV之前和之后，通 过针对肌肉活检的蛋白质印迹或免疫组织化学来测量肌营养不良蛋 白水平，从而检测微小肌营养不良蛋白阳性纤维的数量。此外，通 过检测更多的每个细胞核的载体基因组的数量来测量患者中的微小 肌营养不良蛋白基因的表达，其中每个细胞核1个载体基因组为约 50％的微小肌营养不良蛋白表达，并且每个细胞核大于1个拷贝与 微小肌营养不良蛋白表达水平一致。例如，细胞具有每个细胞核1.2 个载体拷贝、或每个细胞核1.3个载体拷贝、或每个细胞核1.4个载 体拷贝、或每个细胞核1.5个载体拷贝、或每个细胞核1.6个载体拷 贝、或每个细胞核1.7个载体拷贝、或每个细胞核1.8个载体拷贝、 或每个细胞核1.9个载体拷贝。

在另一个实施方案中，本发明提供了增加有需要的患者中的α- 肌聚糖的表达的方法，所述方法包括将SEQ ID NO:9的 AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022施用于所述患者。例如，在施用rAAV 之前和之后，通过针对肌肉活检的蛋白质印迹或免疫组织化学来测 量α-肌聚糖蛋白水平，从而检测α-肌聚糖的水平。

此外，本发明提供了增加有需要的患者中的β-肌聚糖的表达的 方法，所述方法包括将SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营 养不良蛋白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、 SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022 施用于所述患者。例如，在施用rAAV之前和之后，通过针对肌肉 活检的蛋白质印迹或免疫组织化学来测量β-肌聚糖蛋白水平，从而 检测β-肌聚糖的水平。

本发明还提供了治疗患有杜兴肌营养不良或贝克尔肌营养不良 的患者的方法，所述方法包括将SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7. 微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸 55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO：6的核苷 酸56-5022施用于所述患者，以使得所述患者的疾病进展延迟，如 通过以下测试中的任一者来测量：六分钟步行测试、起立时间、上 升4梯、上升和下降4梯、北极星移动评估量表(NSAA)、10米 计时测试、100米计时测试、手持式肌力测定(HHD)、计时起立- 行走和/或大幅运动子测试量表(Bayley-III)分数。

例如，在任何方法中，与施用rAAV前的NSAA得分相比，在 施用rAAV后至少270天，受试者的NSAA得分具有至少6分的改 善。此外，在任何方法中，与施用rAAV前的起立时间相比，在施 用rAAV后至少270天，受试者的起立时间具有至少约0.8秒的改善。 此外，在任何方法中，与施用rAAV前的上升4梯的时间测试相比， 在施用rAAV后至少270天，受试者的上升4梯的时间测试具有至 少约1.2秒的改善。此外，在任何方法中，与施用rAAV前的100m 计时测试相比，在施用rAAV后至少270天，受试者的100m计时测 试具有至少约7秒的改善。

“纤维化”是指胞外基质(ECM)组分的过多或不受控制的沉积 以及受伤后组织(包括骨骼肌、心肌、肝、肺、肾和胰腺)的异常 修复过程。沉积的ECM组分包括纤连蛋白和胶原蛋白(例如胶原蛋 白1、胶原蛋白2或胶原蛋白3)。

本发明还提供了减少或预防患有肌营养不良的受试者的纤维化 的方法，所述方法包括施用治疗有效量的rAAV或rAAV载体，所 述rAAV包含SEQ ID NO:1的人微小肌营养不良蛋白核苷酸序列和 SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子核苷酸序列；所述 rAAV载体包含SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良 蛋白构建体核苷酸序列、SEQ IDNO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022。在一 个实施方案中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白。 在一个实施方案中，AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋 白。在另一个实施方案中，AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白 是SEQID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白。在另一 个实施方案中，AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5066的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白。在又一个实施方案中， rAAV是AAVrh74.MCK.微小肌营养不良蛋白。在一个实施方案中， AAVrh74.MCK.微小肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:5的核苷酸56- 4820的AAVrh74.MCK.微小肌营养不良蛋白。

在另一个实施方案中，本发明提供了预防有需要的受试者的纤 维化的方法，所述方法包括施用治疗有效量的SEQ ID NO:1的人微 小肌营养不良蛋白核苷酸序列和SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:7的 MHCK7启动子核苷酸序列；或rAAV载体，所述rAAV载体包含 SEQ IDNO:9的AAV74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸 序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1- 4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022。例如，本发明的rAAV 中的任一者可以被施用于患有肌营养不良的受试者，以预防纤维化， 例如在受试者中观察到纤维化前，本发明的rAAV表达所施用的人 微小肌营养不良蛋白。此外，表达人微小肌营养不良蛋白基因的本 发明的rAAV可以被施用于具有患上纤维化的风险的受试者，诸如 患有或被诊断为肌营养不良(例如DMD)的那些受试者。本发明的rAAV可以被施用于患有肌营养不良的受试者，以预防这些受试者 的新的纤维化。

本发明设想了在受试者中观察到纤维化前施用rAAV。此外， rAAV可以被施用于具有患上纤维化的风险的受试者，诸如患有或 被诊断为肌营养不良(例如DMD)的那些受试者。rAAV可以被施 用于已发展为纤维化的患有肌营养不良的受试者，以预防这些受试 者的新的纤维化。

本发明还提供了增加患有肌营养不良的受试者的肌肉力量和/或 肌肉质量的方法，所述方法包括施用治疗有效量的SEQ ID NO:1的 人微小肌营养不良蛋白核苷酸序列和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7 的MHCK7启动子核苷酸序列；或rAAV，所述rAAV包含SEQ IDNO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列、 SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、 或SEQ ID NO:6的核苷酸的56-5022。

本发明设想了在受试者中观察到纤维化前、或在肌肉力量减少 前、或在肌肉质量减少前，将rAAV载体施用于被诊断为DMD的 受试者。

本发明还设想了将SEQ ID NO:1的人微小肌营养不良蛋白核苷 酸序列和SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子核苷酸 序列；或rAAV，所述rAAV包含SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022施用于已发展为纤维化的患有肌营养不 良的受试者，以预防这些受试者的新的纤维化或减少这些受试者的 纤维化。本发明还提供了将SEQ ID NO:1的人微小肌营养不良蛋白 核苷酸序列和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子核 苷酸序列；或rAAV载体，所述rAAV载体包含SEQ ID NO:9的 AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022施用于肌肉力量已减少或肌肉质量已减 少的患有肌营养不良的受试者，以保护肌肉免受进一步损伤。

在本发明的方法中的任一者中，受试者可以患有肌营养不良 (诸如DMD)或任何其肌营养不良蛋白相关的肌营养不良。

在本文所述的发明的方法中的任一者的其他实施方案中，与施 用rAAV前的血清CK水平相比，在施用rAAV后，受试者的血清 CK水平降低选自由以下各项组成的组的百分比水平：

a)在施用后90、180或270天至少78％；

b)在施用后270天至少46％、55％、56％、57％、58％、59％、 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％ 或85％；

c)在施用后180天至少72％、73％、74％或95％；

d)在施用后90天至少87％、88％、93％或95％；

e)在施用后270天至少70％；

f)在施用后90、180或270天70％至95％；

g)在施用后90、180或270天至少56％、57％、58％、59％、 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、 70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％或95％；以及

h)在施用后90、180或270天至少56％、57％、58％、59％、 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、 70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％或95％。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗有需要的人受试 者的肌营养不良的组合物，其中所述组合物包含一定剂量的重组腺 病毒(rAAV)相关rAAV.MHCK7.微小肌营养不良蛋白，其中所述 组合物被配制用于全身性施用途径，并且rAAV的剂量为约1×10

例如，本发明的组合物包含约5.0×10

在一个实施方案中，本发明的组合物被配制用于静脉内施用， 并且包含约2.0×10

在本发明的组合物中的任一者中，rAAV的剂量以约5mL/kg至 约15mL/kg、或约8mL/kg至约12mL/kg、或8mL/kg至约10mL/kg、 或5mL/kg至约10mL/kg、或约10mL/kg至12mL/kg、或约10mL/kg 至15mL/kg、或10mL/kg至约20mL/kg递送。在一个特定实施方案 中，组合物包含以约10mL/kg递送的rAAV的剂量。在一个实施方 案中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白。在一个实 施方案中，AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:9 的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白、SEQ ID NO:3的核苷酸 55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷 酸56-5022。在另一个实施方案中，rAAV是AAVrh74.MCK.微小肌 营养不良蛋白。在一个实施方案中，AAVrh74.MCK.微小肌营养不 良蛋白是SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌 营养不良蛋白。

本发明的组合物被配制用于通过注射、输注或移植来施用。例 如，组合物被配制用于通过经大约一小时的输注来施用。此外，本 发明的组合物被配制用于通过外周肢静脉(诸如，外周臂静脉或外 周腿静脉)来静脉内施用。或者，输注可以经大约30分钟、或大约1.5小时、或大约2小时、或大约2.5小时、或大约3小时施用。

本发明的组合物中的任一者包含rAAV或rAAV载体，所述 rAAV包含SEQ ID NO:1的人微小肌营养不良蛋白核苷酸序列和 SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列，所述rAAV 载体包含SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构 建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8 的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022。

具体而言，本发明的组合物用于治疗杜兴肌营养不良或贝克尔 肌营养不良。例如，本发明提供了用于治疗有需要的人受试者的杜 兴肌营养不良或贝克尔肌营养不良的组合物，其中所述组合物包含 一定剂量的重组腺病毒(rAAV)相关rAAV.MHCK7.微小肌营养不 良蛋白，其中所述组合物被配制用于通过经大约一小时的静脉内输 注来施用，并且所施用rAAV的剂量为约2×10

在另一个实施方案中，本发明还提供了包含rAAV的组合物， 所述组合物用于减少有需要的受试者的纤维化。此外，本发明提供 了包含rAAV载体的组合物，所述组合物用于预防患有肌营养不良 的受试者的纤维化。

本发明还提供了包含rAAV的组合物，所述组合物用于增加患 有肌营养不良的受试者的肌肉力量和/或肌肉质量。在另一个实施方 案中，本发明提供了包含本发明的rAAV中的任一者的组合物，所 述组合物用于治疗肌营养不良。

在本发明的组合物中的任一者的其他实施方案中，与施用组合 物前的血清CK水平相比，在所述组合物施用于需要治疗肌营养不 良的人受试者后，受试者的血清CK水平降低选自由以下各项组成 的组的百分比水平：

a)在施用后90、180或270天至少78％；

b)在施用后270天至少46％、55％、70％或85％；

c)在施用后180天至少72％、73％、74％或95％；

d)在施用后90天至少87％、99％、93％或95％；

e)在施用后270天至少70％；

f)在施用后90、180或270天70％至95％；

g)在施用后90、180或270天至少69％、70％、71％、72％、 73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％或95％；以及

h)在施用后90、180或270天69％、70％、71％、72％、73％、 74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％ 或95％。

在另一个实施方案中，本发明提供了一定剂量的重组腺病毒 (rAAV)相关rAAV.MHCK7.微小肌营养不良蛋白用于制备用来治 疗有需要的人受试者的肌营养不良的药物的用途，其中所述药物被 配制用于全身性施用途径，并且rAAV的剂量为约1×10

例如，药物包含约5.0×10

在一个实施方案中，本发明的药物被配制用于一定剂量的 rAAV的全身性施用，其中所述全身性施用途径是静脉内途径，并 且所施用的rAAV的剂量为约2.0×10

在本发明的用途中的任一者中，药物包含约5mL/kg至约 15mL/kg、或约8mL/kg至约12mL/kg、或8mL/kg至约10mL/kg、 或5mL/kg至约10mL/kg、或约10mL/kg至12mL/k、或约10mL/kg 至15mL/kg、或10mL/kg至约20mL/kg的剂量的rAAV。在一个特 定实施方案中，剂量或rAAV为约10mL/kg。在一个实施方案中， rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白。在一个实施方案 中，AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白、SEQ ID NO:3的核苷酸 55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷 酸56-5022。在一个实施方案中，rAAV是AAVrh74.MCK.微小肌营 养不良蛋白。在一个实施方案中，AAVrh74.MCK.微小肌营养不良 蛋白是SEQ IDNO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌营 养不良蛋白。

在本发明的用途中的任一者中，药物被配制用于通过注射、注 或移植来施用。例如，药物被配制用于通过经大约一小时的输注来 施用。此外，药物被配制用于通过外周肢静脉(诸如，外周臂静脉 或外周腿静脉)来静脉内施用。或者，输注可以经大约30分钟、或大约1.5小时、或大约2小时、或大约2.5小时、或大约3小时施用。

在本发明的用途中的任一者中，药物包含rAAV，所述rAAV 包含SEQ ID NO:1的人微小肌营养不良蛋白核苷酸序列和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列、或SEQID NO:9的 AAVrh74.MHCK7微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022。

本发明的特定用途是制备用治疗杜兴肌营养不良或贝克尔肌营 养不良的药物。例如，本发明提供了一定剂量的重组腺病毒(rAAV) 相关rAAV.MHCK7.微小肌营养不良蛋白用于制备用来治疗有需要 的人受试者的杜兴肌营养不良或贝克尔肌营养不良的药物的用途， 其中所述药物被配制用于通过经大约一小时的静脉内输注来施用， 并且所施用的rAAV的剂量为约2×10

在另一个实施方案中，本发明提供了rAAV用于制备用来减少 有需要的受试者的纤维化的药物的用途。例如，有需要的受试者可 以患有肌营养不良(诸如DMD)或任何其他肌营养不良蛋白相关的 肌营养不良。

在另一个实施方案中，本发明提供了rAAV用于制备用来预防 患有肌营养不良的受试者的纤维化的药物的用途。

此外，本发明提供了rAAV用于制备用来增加患有肌营养不良 的受试者的肌肉力量和/或肌肉质量的药物的用途。

本发明还提供了rAAV用于制备用来治疗肌营养不良的药物的 用途。

本发明提供了rAAV载体用于制备用来治疗肌营养不良的药物 的用途：所述rAAV载体包含SEQ ID NO:1的人微小肌营养不良蛋 白核苷酸序列和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子 核苷酸序列，或者rAAV载体用于治疗肌营养不良的用途：所述 rAAV载包含SEQ ID NO:9的AAVrf74.MHCK7.微小肌营养不良蛋 白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022。

在本发明的用途中的任一者的其他实施方案中，与施用rAAV 前的血清CK水平相比，在rAAV施用于受试者后，受试者血清CK 水平降低选自由以下各项组成的组的百分比水平：

a)在施用后90、180或270天至少78％；

b)在施用后270天至少46％、55％、70％或95％；

c)在施用后180天至少72％、73％、74％或95％；

d)在施用后90天至少87％、88％、93％或95％；

e)在施用后270天至少70％；

f)在施用后90、180或270天70％至95％；

g)在施用后90、180或270天至少69％、70％、71％、72％、 73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％或95％；以及

h)在施用后90、180或270天69％、70％、71％、72％、73％、 74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％ 或95％。

在用于治疗肌营养不良的组合物或用于治疗肌营养不良的药物 的用途中的任一者中，在所述组合物或药物的施用后，受试者的细 胞中的微小肌营养不良蛋白基因表达的水平增加。在所述组合物或 药物的施用前和施用后，通过活检肌肉中的蛋白质印迹来测量微小 肌营养不良蛋白水平，从而检测微小肌营养不良蛋白基因在细胞中 的表达。具体而言，与所述组合物或药物的施用前微小肌营养不良 蛋白的水平相比，在所述组合物或药物的施用后，微小肌营养不良 蛋白的水平增加至少约70％至至少约80％、或至少约70％至至少约 90％、或至少约80％至至少约90％。例如，与所述组合物或药物的 施用前微小肌营养不良蛋白的水平相比，在所述组合物的施用后， 微小肌营养不良蛋白的水平增加至少约70％、或至少约71％、或至 少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约 80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约 84％、或至少约85％。

此外，通过在所述组合物或药物的施用前和施用后肌肉活检中 的免疫组织化学来测量微小肌营养不良蛋白水平，从而检测微小肌 营养不良蛋白基因在细胞中的表达。与所述组合物或药物的施用前 微小肌营养不良蛋白的水平相比，在施用rAAV后，微小肌营养不 良蛋白的水平增加至少约70％至至少约80％、或至少约70％至至少 约90％、或至少约80％至至少约90％。例如，与所述组合物或药物 的施用前微小肌营养不良蛋白的水平相比，在所述组合物或药物的 施用后，微小肌营养不良蛋白的水平增加至少约70％、或至少约 71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约 75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约 79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约 83％、或至少约84％、或至少约85％。

在用于治疗肌营养不良的组合物中的任一者中，与所述组合物 或药物的施用前血清CK水平相比，在施用rAAV后，受试者的血 清CK水平降低。例如，与所述组合物或药物的施用前血清CK水 平相比，在所述组合物或药物的施用后60天，受试者的血清CK水 平降低约65％至约90％、或约65％至约95％、或约75％至约90％、 或约80％至约90％、或约85％至约95％、或约87％至约95％、或约 87％至约90％。具体而言，在用于治疗本发明的肌营养不良的组合 物中的任一者中，与所述组合物或药物的施用前血清CK水平相比， 在所述组合物或药物的施用后60天，受试者的血清CK水平降低约 87％，或者在本发明的用于治疗肌营养不良的组合物或用于治疗肌 营养不良的药物的用途中的任一者中，与所述组合物或药物的施用 前血清CK水平相比，在所述组合物或药物的施用后60天，受试者 的血清CK水平降低约72％，或者在用于治疗本发明的肌营养不良 的组合物中的任一者中，与所述组合物或药物的施用前血清CK水 平相比，在所述组合物或药物的施用后60天，受试者的血清CK水平降低约73％，或者在本发明的用于治疗肌营养不良的组合物或用 于治疗肌营养不良的药物的用途中的任一者中，与施用所述组合物 前的血清CK水平相比，在所述组合物或药物的施用后60天，受试 者的血清CK水平降低约78％，或者在本发明的用于治疗肌营养不 良的组合物或用于治疗肌营养不良的药物的用途中的任一者中，与 所述组合物或药物的施用前血清CK水平相比，在所述组合物或药 物的施用后60天，受试者的血清CK水平降低约95％。在用于治疗 肌营养不良的组合物或用于治疗肌营养不良的药物的用途中的任一 者中，与所述组合物或药物的施用前微小肌营养不良蛋白阳性纤维 的数量相比，在所述组合物或药物的施用后，受试者的肌肉组织中 的微小肌营养不良蛋白阳性纤维的数量增加。例如，在所述组合物 或药物的施用前和施用后，通过针对肌肉活检的蛋白质印迹或免疫 组织化学来测量微小肌营养不良蛋白水平，从而检测微小肌营养不 良蛋白阳性纤维的数量。

在用于治疗肌营养不良的组合物或用于治疗肌营养不良的药物 的用途中的任一者中，所述组合物或药物的施用使DAPC蛋白(诸 如α-肌聚糖或β-肌聚糖)的表达上调。例如，与所述组合物或药物 的施用前α-肌聚糖的水平相比，在所述组合物或药物的施用后，受 试者中的α-肌聚糖的水平增加。此外，与所述组合物或药物的施用 前β-肌聚糖的水平相比，在所述组合物或药物的施用后，受试者中 的β-肌聚糖的水平增加。在所述组合物或药物的施用前和施用后， 通过针对肌肉活检的蛋白质印迹或免疫组织化学来测量α-肌聚糖或 β-肌聚糖蛋白水平，从而检测α-肌聚糖或β-肌聚糖的水平。

在用于治疗肌营养不良的组合物或用于治疗肌营养不良的药物 的用途中的任一者中，在所述组合物或药物的施用后，受试者的疾 病进展延迟，如通过以下测试中的任一者来测量：六分钟步行测试、 起立时间、上升4梯、上升和下降4梯、北极星移动评估量表(NSAA)、10米计时测试、100米计时测试、手持式肌力测定 (HHD)、计时起立-行走和/或大幅运动子测试量表(Bayley-III) 分数。

例如，在用于治疗肌营养不良的组合物或用于治疗肌营养不良 的药物的用途中的任一者的施用后，与施用rAAV前的NSAA得分 相比，在所述组合物或药物的施用后至少270天，受试者的NSAA 得分具有至少6分的改善。此外，在任何方法中，与所述组合物或 药物的施用前起立时间相比，在所述组合物或药物的施用后至少 270天，受试者的起立时间具有至少约0.8秒的改善。此外，在本发 明的方法或用途中的任一者中，与所述组合物或药物的施用前上升 4梯的时间测试相比，在所述组合物或药物的施用后至少270天，受 试者的上升4梯的时间的测试具有至少约1.2秒的改善。此外，在本 发明的方法或用途中的任一者中，与所述组合物或药物的施用前 100m计时测试相比，在所述组合物或药物的施用后至少270天，受 试者的100m计时测试具有至少约7秒的改善。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于在患者细胞中表达微 小肌营养不良蛋白基因的组合物，所述组合物包含SEQ ID NO:9的 AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ IDNO:6的核苷酸56-5022。在另一个实施方案中，本发明提供了使 用一定剂量的SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋 白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022来制备在患 者细胞中表达微小肌营养不良蛋白基因的药物的用途。例如，在施 用rAAV.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体之前和之后，通过肌 肉活检中的蛋白质印迹或免疫组织化学来测量微小肌营养不良蛋白 水平，从而检测微小肌营养不良蛋白基因在患者细胞中的表达。此 外，通过检测更多的每个细胞核的载体基因组的数量来测量患者中 的微小肌营养不良蛋白基因的表达，其中每个细胞核1个载体基因 组为约50％的微小肌营养不良蛋白表达，并且每个细胞核大于1个 拷贝与微小肌营养不良蛋白表达水平一致。例如，细胞具有每个细 胞核1.2个载体拷贝、或每个细胞核1.3个载体拷贝、或每个细胞核 1.4个载体拷贝、或每个细胞核1.5个载体拷贝、或每个细胞核1.6 个载体拷贝、或每个细胞核1.7个载体拷贝、或每个细胞核1.8个载 体拷贝、或每个细胞核1.9个载体拷贝。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于减少有需要的患者的 血清CK水平的组合物，所述组合物包含SEQ ID NO:9的 AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022。此外，本发明提供了使用一定剂量的 SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷 酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸 1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022来制备降低有需要的患 者中的血清CK水平的药物的用途。例如，与所述组合物或药物的 施用前血清CK水平相比，在所述组合物或药物的施用后60天，患 者中的血清CK水平降低至少约65％至约90％、或约65％至约95％、 或约75％至约90％、或约80％至约90％、或约85％至约95％、或约 87％至约95％、或约87％至约90％。具体而言，受试者的血清CK 水平，与所述组合物或药物的施用前血清CK水平相比，在所述组 合物或药物的施用后60天减少约87％，或者与所述组合物或药物的 施用前血清CK水平相比，在所述组合物或药物的施用后60天减少 约72％，或者与所述组合物或药物的施用前血清CK水平相比，在 所述组合物或药物的施用后60天减少约73％，或者与所述组合物或 药物的施用前血清CK水平相比，在所述组合物或药物的施用后60 天减少约78％，或者与所述组合物或药物的施用前血清CK水平相 比，在所述组合物或药物的施用后60天减少约95％。

本发明还提供了用于增加患者肌肉组织中的微小肌营养不良蛋 白阳性纤维的组合物，所述组合物包含SEQ ID NO:9的 AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022。此外，本发明提供了使用一定剂量的 SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷 酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸 1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022来制备增加患者肌肉组 织中的微小肌营养不良蛋白阳性纤维的药物的用途。例如，在所述 组合物或药物的施用前和施用后，通过针对肌肉活检的蛋白质印迹 或免疫组织化学来测量肌营养不良蛋白水平，从而检测微小肌营养 不良蛋白阳性纤维的数量。此外，通过检测更多的每个细胞核的载 体基因组的数量来测量患者中的微小肌营养不良蛋白基因的表达， 其中每个细胞核1个载体基因组为约50％的微小肌营养不良蛋白表 达，并且每个细胞核大于1个拷贝与微小肌营养不良蛋白表达水平 一致。例如，细胞具有每个细胞核1.2个载体拷贝、或每个细胞核 1.3个载体拷贝、或每个细胞核1.4个载体拷贝、或每个细胞核1.5 个载体拷贝、或每个细胞核1.6个载体拷贝、或每个细胞核1.7个载 体拷贝、或每个细胞核1.8个载体拷贝、或每个细胞核1.9个载体拷 贝。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于增加有需要的患者中 的α-肌聚糖的表达的组合物，所述组合物包含SEQ ID NO:9的 AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022。本发明还提供了使用一定剂量的SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序 列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1- 4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022来制备增加有需要的患者 中的α-肌聚糖的表达的药物的用途。例如，在所述组合物或药物的 施用前和施用后，通过针对肌肉活检的蛋白质印迹或免疫组织化学 来测量α-肌聚糖蛋白水平，从而检测α-肌聚糖的水平。

此外，本发明提供了用于增加有需要的患者中的β-肌聚糖的表 达的组合物，所述组合物包含SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微 小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列、SEQID NO:3的核苷酸55- 5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷酸 56-5022。本发明还提供了使用SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7. 微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸 55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷 酸56-5022来制备增加有需要的患者中的β-肌聚糖的表达的药物的 用途。例如，在所述组合物或药物的施用前和施用后，通过针对肌 肉活检的蛋白质印迹或免疫组织化学来测量β-肌聚糖蛋白水平，从 而检测β-肌聚糖的水平。

本发明还提供了一定剂量的SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7. 微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸 55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、或SEQ ID NO:6的核苷 酸56-5022用于制备用来治疗患有杜兴肌营养不良或贝克尔肌营养不良的患者的药物，以使得所述药物的施用引起患者的疾病进展延 迟的用途，如通过以下测试中的任一者来测量：六分钟步行测试、 起立时间、上升4梯、上升和下降4梯、北极星移动评估量表 (NSAA)、10米计时测试、100米计时测试、手持式肌力测定 (HHD)、计时起立-行走和/或大幅运动子测试量表(Bayley-III) 分数。

例如，与所述组合物或药物的施用前NSAA得分相比，在所述 组合物或药物的施用后至少270天，受试者的NSAA得分具有至少 6分的改善。此外，与所述组合物或药物的施用前起立时间相比， 在所述组合物或药物的施用后至少270天，受试者的起立时间具有 至少约0.8秒的改善。此外，与所述组合物或药物的施用前上升4梯 的时间测试相比，在所述组合物或药物的施用后至少270天，受试 者的上升4梯的时间的测试具有至少约1.2秒的改善。此外，与所述 组合物或药物的施用前100m计时测试相比，在所述组合物或药物 的施用后至少270天，受试者的100m计时测试具有至少约7秒的改 善。

附图说明

图1展示了rAAV.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体。在该 构建体中，cDNA表达盒侧接有AAV2反向末端重复序列(ITR)。 所述构建体的特征在于框内棒状结构域缺失(R4-R23)，而铰链1、 2和4(H

图2提供了AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白的核酸序列 (SEQ ID NO:3)。

图3提供了pNLREP2-Caprh74AAV辅助质粒图。

图4提供了Ad辅助质粒pHELP。

图5展示了rAAV.MCK.微小肌营养不良蛋白质粒构建体。

图6提供了rAAVrh74.MCK.微小肌营养不良蛋白的核酸序列 (SEQ ID NO:5)。

图7展示了通过免疫细胞化学测量的腓肠肌的肌纤维活检中的 微小肌营养不良蛋白基因表达。

图8A-8C提供了展示正确分子量的微小肌营养不良蛋白表达的 蛋白质印迹。在图8C中，将受试者4的样品(*)1:4稀释(至线性 范围)，因为在初始分析中ULDQ(>80％)超标，并且相对于正常 值，将平均值乘最终值的稀释校正因子。相对于正常值的平均微小 肌营养不良蛋白表达在方法1中为182.7％，在方法2中为222.0％。

图9A-9C展示了rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白的施 用使DAPC蛋白、α-肌聚糖和β-肌聚糖的表达上调。

图10展示了在施用rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白的 情况下，肌酸激酶(CK)的持续显著减少。

图11提供了从基线至第270天的平均CK变化。该数据表明， 在施用rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白后，CK随时间推移 显著减少。

图12提供了从基线至第270天的平均NSAA变化和平均CK变 化。该数据表明，在施用rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白后， NSAA随时间推移显著增加。

图提供了AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白的核酸序列 (SEQ ID NO:9)。

图14展示了AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白质粒构建 体。

包含卡那霉素抗性基因的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋 白质粒构建体。

具体实施方式

本发明提供了过表达人微小肌营养不良蛋白的基因治疗载体 (例如rAAV载体)以及减少和预防肌营养不良患者的纤维化的方 法。在DMD诊断的早期采集的肌肉活检样品显示出显著的结缔组 织增生。肌肉纤维化以多种方式产生有害影响。它通过结缔组织屏 障来减少肌内膜营养物的正常运输，减少血流量，剥夺肌肉的血管 源性营养成分，并且在功能上造成了由于肢体挛缩而产生的早期行 走能力丧失。随时间推移，由于明显的肌肉纤维化，治疗的挑战也 越来越多。这可以在比较连续时间点的结缔组织增生的肌肉活检中 观察到。该过程继续加剧，导致行走能力丧失，并且加速失控，尤 其是在轮椅依赖性患者中。

如果不进行早期治疗(包括减少纤维化的平行方法)，就不可 能完全实现外显子跳跃、终止密码子通读或基因替代疗法的有益效 果。如果不进行减少肌肉纤维化的方法，即使是小分子或蛋白质替 代策略也可能会失败。此前对已经纤维化并且用AAV.微小肌营养不 良蛋白治疗的老年mdx小鼠的研究表明，我们无法实现完全功能恢 复(Liu,M.等人,Mol Ther 11,245-256(2005))。还已知，DMD心 肌病的进展伴随着心室壁的瘢痕形成和纤维化。

如本文所用，术语“AAV”是腺相关病毒的标准缩写。腺相关病 毒是一种单链DNA细小病毒，仅在某些功能由共感染辅助病毒提供 的细胞中生长。目前已鉴定出十三种AAV血清型。AAV的一般信 息和综述可见于例如Carter,1989,Handbook of Parvoviruses,第1卷, 第169-228页和Berns,1990,Virology,第1743-1764页,Raven Press, (New York)。然而，完全可以预期，这些相同的原理也将适用于其 他AAV血清型，因为以下事实是熟知的：即使在遗传水平上，各种 血清型在结构和功能上都非常密切相关。(参见，例如Blacklowe,1988,Parvoviruses and Human Disease第165-174页,J.R.Pattison编； 和Rose,Comprehensive Virology 3:1-61(1974))。例如，所有AAV 血清型都明显表现出由同源rep基因介导的非常相似的复制性质； 并且都携带三种相关的衣壳蛋白，诸如在AAV2中表达的那些。异 源双链分析进一步表明了相关性程度，所述异源双链分析显示出沿 着基因组长度的血清型之间的广泛交叉杂交；并且在对应于“反向末 端重复序列”(ITR)的末端存在类似的自退火区段。相似的感染性 模式还表明，每种血清型中的复制功能都处于相似的调控性控制下。

如本文所用，“AAV载体”是指包含一个或多个侧接有AAV末 端重复序列(ITR)的所关注的多核苷酸(或转基因)的载体。当此 类AAV载体存在于已经转染有编码和表达rep和cap基因产物的载 体的宿主细胞中时，它们可以被复制和包装成感染性病毒颗粒。

“AAV病毒粒子”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”是指由 至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳包裹的多核苷酸AAV载体组成的病 毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组之 外的多核苷酸，诸如将要递送至哺乳动物细胞的转基因)，则所述 颗粒通常称为“AAV载体颗粒”或简称为“AAV载体”。因此，AAV 载体颗粒的产生必然包括AAV载体的产生，因为这种载体包含在 AAV载体颗粒内。

腺相关病毒(AAV)是一种复制缺陷型细小病毒，它的单链 DNA基因组的长度为约4.7kb，其中包括145个核苷酸的反向末端 重复序列(ITR)。AAV有多种血清型。AAV血清型的基因组的核 苷酸序列是已知的。例如，AAV血清型2(AAV2)基因组的核苷 酸序列提供于Srivastava等人,J Virol,45:555-564(1983)中，由 Ruffing等人,J Gen Virol,75:3385-3392(1994)进行了修改。作为其 他实例，AAV-1的完整基因组提供于GenBank登录号NC_002077 中；AAV-3的完整基因组提供于GenBank登录号NC_1829中；AAV-4的完整基因组提供于GenBank登录号NC_001829中；AAV- 5基因组提供于GenBank登录号AF085716中；AAV-6的完整基因 组提供于GenBank登录号NC_00 1862中；AAV-7和AAV-8基因组 的至少一部分分别提供于GenBank登录号AX753246和AX753249 中(另外参见涉及AAV-8的美国专利号7,282,199和7,790,449)； AAV-9基因组提供于Gao等人,J.Virol.,78:6381-6388(2004)中；AAV-10基因组提供于Mol.Ther.,13(1):67-76(2006)中；并且AAV- 11基因组提供于Virology,330(2):375-383(2004)中。AAVrh.74血清 型的克隆在Rodino-Klapac等人,Journal of translational medicine 5, 45(2007)中有所描述。指导病毒DNA复制(rep)的顺式作用序列， 衣壳包裹/包装和宿主细胞染色体整合被包含在ITR内。三个AAV 启动子(因它们的相对图谱位置而命名为p5、p19和p40)驱动编 码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个rep启 动子(p5和p19)，与单个AAV内含子的差异剪接(例如，在 AAV2核苷酸2107和2227处)结合，从而从rep基因产生四个rep 蛋白(rep 78、rep 68、rep 52和rep 40)。Rep蛋白具有多个酶学性 质，这些酶学性质最终负责病毒基因组的复制。cap基因从p40启动 子表达，它编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。可变剪接和非共 有翻译起始位点负责三种相关衣壳蛋白的产生。单个共有多腺苷酸 化位点定位于AAV基因组的图谱位置95。AAV的生命周期和遗传 学在Muzyczka,Current Topics in Microbiology andImmunology,158: 97-129(1992)中进行综述。

AAV具有独特的特征，这些特征使其成为具有吸引力的载体， 所述载体用于例如在基因疗法中将外源DNA递送至细胞。培养物中 的细胞的AAV感染是非致细胞病变的，并且人和其他动物的自然感 染是沉默和无症状的。此外，AAV感染很多哺乳动物细胞，从而可能在体内靶向很多不同的组织。此外，AAV转导缓慢分裂和不分裂 的细胞，并且可以基本上作为转录活性核附加体(染色体外元件) 在这些细胞的生命周期中持续存在。AAV前病毒基因组作为质粒中 的克隆DNA具有感染性，这使重组基因组的构建成为可能。此外， 由于指导AAV复制的信号，基因组衣壳包裹和整合被包含在AAV 基因组的ITR内，因此内部大约4.3kb基因组的一部分或全部(编 码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可以被替换为外源DNA，诸如含 有启动子的基因盒、所关注的DNA和多腺苷酸化信号。rep和cap 蛋白可以以反式提供。AAV的另一个显著特征是它是一种极其稳定 和强壮的病毒。它可以轻松承受用于灭活腺病毒的条件(56℃至 65℃若干小时)，从而使AAV的冷冻保存不再成为关键因素。AAV甚至可以是冻干的。最后，AAV感染的细胞对超感染无耐受 性。

多项研究表明，重组AAV介导的蛋白质可以在肌肉中长期表达 (>1.5年)。参见Clark等人,Hum Gene Ther,8:659-669(1997)； Kessler等人,Proc Nat.Acad Sc.USA,93:14082-14087(1996)和Xiao 等人,J Virol,70:8098-8108(1996)。另外参见Chao等人,MolTher, 2:619-623(2000)和Chao等人,Mol Ther,4:217-222(2001)。此外，由 于肌肉是高度血管化的，因此在肌肉内注射后，重组AAV转导引起 全身循环中出现转基因产物，如Herzog等人,Proc Natl Acad Sci USA, 94:5804-5809(1997)和Murphy等人,Proc Natl AcadSci USA,94: 13921-13926(1997)所述。此外，Lewis等人,J Virol,76:8769-8775 (2002)展示了，骨骼肌纤维具有校正抗体糖基化、折叠和分泌所必需 的细胞因子，这表明肌肉能够稳定表达分泌性蛋白质治疗剂。

本发明的重组AAV基因组包含本发明的核酸分子和一个或多个 侧接核酸分子的AAV ITR。rAAV基因组中的AAV DNA可以来自 可以衍生出重组病毒的任何AAV血清型，包括但不限于AAV血清 型AAVrh.74、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、 AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12和AAV-13。 假型rAAV的产生在例如WO 01/83692中有所公开。还设想了其他 类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见例如Marsic 等人,Molecular Therapy,22(11):1900-1909(2014)。如以上背景技术 部分所述，各种AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域已知的。 为了促进骨骼肌特异性表达，可以使用AAV1、AAV6、AAV8或 AAVrh.74。

本发明的DNA质粒包含本发明的rAAV基因组。将DNA质粒 转移至允许被AAV的辅助病毒(例如，腺病毒、E1缺失的腺病毒 或疱疹病毒)感染的细胞，以将rAAV基因组组装成感染性病毒颗 粒。产生rAAV颗粒的技术是本领域的标准技术，其中将要包装的 AAV基因组、rep和cap基因以及辅助病毒功能元件被提供给细胞。 rAAV的产生需要在单个细胞(在本文中称为包装细胞)内提供以 下组分：rAAV基因组、与rAAV基因组分离(即不在rAAV基因组中)的AAV rep和cap基因、以及辅助病毒功能元件。AAV rep和 cap基因可以来自可以衍生出重组病毒的任何AAV血清型，并且可 以来自与rAAV基因组ITR不同的AAV血清型，包括但不限于 AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、 AAV-7、AAVrh.74、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV- 12和AAV-13。假型rAAV的产生在例如WO 01/83692中有所公开， 该公开以引用的方式整体并入本文。

产生包装细胞的方法是产生稳定表达用于AAV颗粒产生的所有 必要组分的细胞系。例如，将包含缺乏AAV rep和cap基因的 rAAV基因组、与rAAV基因组分离的AAV rep和cap基因以及选择 性标记(诸如新霉素抗性基因)的质粒(或多个质粒)整合进细胞 的基因组。AAV基因组已经通过诸如GC加尾法(Samulski等人, 1982,Proc.Natl.Acad.S6.USA,79:2077-2081)，添加含有限制性核 酸内切酶切割位点的合成接头(Laughlin等人,1983,Gene,23:65-73) 的程序，或者通过直接平端连接(Senapathy&Carter,1984,J.Biol.Chem.,259:4661-4666)引入细菌质粒中。然后用辅助病毒(诸如腺 病毒)感染包装细胞系。该方法的优点是，细胞是可选择的，并且 适用于rAAV的大规模产生。合适方法的其他实例采用腺病毒或杆 状病毒而不是质粒，以将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包 装细胞中。

rAAV产生的一般原理在例如Carter,1992,Current Opinions inBiotechnology,1533-539；和Muzyczka,1992,Curr.Topics in Microbial.and Immunol.,158:97-129中有所综述。各种方法在 Ratschin等人,Mol.Cell.Biol.4:2072(1984)；Hermonat等人,Proc. Natl.Acad.Sci.USA,81:6466(1984)；Tratschin等人,Mo1.Cell.Biol. 5:3251(1985)；McLaughlin等人,J.Virol.,62:1963(1988)；和Lebkowski等人,Mol.Cell.Biol.,7:349(1988)。Samulski等人,J. Virol.,63:3822-3828(1989)；美国专利No.5,173,414；WO 95/13365 和对应的美国专利No.5,658.776；WO 95/13392；WO 96/17947； PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243 (PCT/FR96/01064)；WO99/11764；Perrin等人Vaccine 13:1244-1250 (1995)；Paul等人Human Gene Therapy 4:609-615(1993)；Clark等人 Gene Therapy 3:1124-1132(1996)；美国专利号5,786,211；美国专利 号5,871,982；和美国专利号6,258,595中有所描述。前述文档据此 以引用的方式整体并入本文，特别需要强调的是文档中涉及rAAV 产生的那些部分。

因此，本发明提供了产生感染性rAAV的包装细胞。在一个实 施方案中，包装细胞可以是稳定转化的癌细胞，诸如HeLa细胞、 293细胞和PerC.6细胞(同源293细胞系)。在另一个实施方案中， 包装细胞是未转化的癌细胞，诸如低传代293细胞(用腺病毒的E1 转化的人胚胎肾细胞)、MRC-5细胞(人胚胎成纤维细胞)、WI- 38细胞(人胚胎成纤维细胞)、Vero细胞(猴肾细胞)和FRhL-2 细胞(恒河猴胚胎肺细胞)。

本发明的重组AAV(即，感染性衣壳包裹的rAAV颗粒)包含 rAAV基因组。在示例性实施方案中，两种rAAV的基因组均缺乏 AAV rep和cap DNA，也就是说，在基因组的ITR之间不存在AAV rep或cap DNA。可以被构建为包含本发明的核酸分子的rAAV的实 例在国际专利申请号PCT/US2012/047999(WO 2013/016352)中示 出，该专利申请以引用的方式整体并入本文。

在一个示例性实施方案中，通过三重转染方法(Xiao等人,J Virol 72,2224-2232(1998))使用AAV载体质粒rAAV.MHCK7.微小 肌营养不良蛋白、pNLRep2-Caprh74和pHelp来产生本发明的重组 AAV载体，rAAV含有侧接有AAV2反向末端重复序列(ITR)的 微小肌营养不良蛋白基因表达盒。该序列被衣壳包裹成AAVrh74病 毒粒子。所述质粒含有微小肌营养不良蛋白序列以及驱动基因表达 的肌肉特异性启动子的MHCK7增强子和核心启动子元件。所述表 达盒还含有SV40内含子(SD/SA)以促进高水平基因表达，并且牛 生长激素多腺苷酸化信号用于有效转录终止。

pNLREP2-Caprh74是AAV辅助质粒，它编码来自血清型rh74 的4种野生型AAV2rep蛋白和3种野生型AAV VP衣壳蛋白。 pNLREP2-Caprh74质粒的示意性图谱如图3所示。

pHELP腺病毒辅助质粒为11,635bp，并且得自Applied Viromics。 所述质粒含有对AAV复制重要的腺病毒基因组的区域，即E2A、 E4ORF6和VA RNA(腺病毒E1功能元件由293细胞提供)。该质 粒中存在的腺病毒序列仅代表腺病毒基因组的～40％，并且不含有复 制关键性顺式元件，诸如腺病毒末端重复序列。所以，预期不会从 这种产生系统中产生感染性腺病毒。pHELP质粒的示意性图谱如图 4所示。

rAAV可以通过作为本领域标准的方法(诸如通过柱色谱法或 氯化铯梯度法)来纯化。从辅助病毒中纯化rAAV载体的方法是本 领域已知的，并且包括在例如Clark等人,Hum.Gene Ther.,10(6): 1031-1039(1999)；Schenpp and Clark,Methods Mol.Med.,69427-443 (2002)；美国专利号6,566,118和WO 98/09657中公开的方法。

在另一个实施方案中，本发明设想了包含本发明的rAAV的组 合物。本发明的组合物包含rAAV和药学上可接受的载剂。所述组 合物还可以包含其他成分，诸如稀释剂和佐剂。可接受的载体、稀 释剂和佐剂对接受者是无毒的，优选地在所采用的剂量和浓度下是惰性的，并且包括缓冲剂和表面活性剂(诸如普朗尼克 (pluronics))。

将要在本发明的方法中施用的rAAV的滴定度将根据例如特定 的rAAV、施用方式、治疗目标、个体和所靶向的一种或多种细胞 类型而变化，并且可以通过作为本领域标准的方法来确定。rAAV 的滴定度的范围可以为每毫升约1×10

本发明设想了在体内或体外用rAAV来转导靶细胞的方法。体 内方法包括将一个有效剂量或多个有效剂量的包含本发明的rAAV 的组合物施用于有需要的动物(包括人类)的步骤。如果在障碍/疾 病发展前施用所述剂量，则所述施用是预防性的。如果在障碍/疾病 发展后施用所述剂量，则所述施用是治疗性的。在本发明的实施方 案中，有效剂量是减轻(消除或减少)与所治疗的障碍/疾病状态相 关的至少一种症状、减慢或预防进展为障碍/疾病状态、减慢或预防 障碍/疾病状态的进展、减少疾病的程度、引起疾病的缓解(部分或 全部)、和/或延长存活期的剂量。所设想的用本发明的方法来预防 或治疗的疾病的实例是DMD。

本发明还设想了组合疗法。本文所用的组合包括同时治疗和顺 序治疗二者。特别设想了本发明的方法与标准药物治疗(例如，皮 质类固醇)的组合，正如与新疗法的组合那样。

有效剂量的组合物的施用可以通过作为本领域标准的途径来进 行，包括但不限于肌肉内、肠胃外、静脉内、口服、面颊、鼻、肺、 颅内、骨内、眼内、直肠或阴道途径。考虑到所治疗的感染和/或疾 病状态以及将要表达微小肌营养不良蛋白的靶细胞/一种或多种组织， 本领域的技术人员可以选择和/或匹配本发明的rAAV的AAV组件 (尤其是，AAV ITR和衣壳蛋白)的一个或多个施用途径和一种或 多种血清型。

本发明提供了有效剂量的rAAV和本发明的组合物的局部施用 和全身性施用。例如，全身性施用是施用于循环系统，从而影响整 体身体。全身性施用包括肠内施用(诸如通过胃肠道吸收)和肠胃 外施用(通过注射、输注或移植进行)。

具体而言，本发明的rAAV的实际施用可以通过使用将rAAV 重组载体运输至动物的靶组织的任何物理方法来完成。根据本发明 的施用包括但不限于注射至肌肉内和注射至血流内。仅将rAAV重 悬于磷酸盐缓冲盐水中即展示出足以提供可用于肌肉组织表达的媒 介物，并且对于可以与rAAV共施用的载剂或其他组分没有已知限 制(虽然在使用rAAV的常规方式中应避免降解DNA的组合物)。 可以修饰rAAV的衣壳蛋白，从而使rAAV靶向所关注的特定靶组 织，诸如肌肉。参见例如WO 02/053703，该公开的公开内容以引用 的方式并入本文。药物组合物可以制备为通过透皮运输递送至肌肉 的注射用制剂或局部制剂。此前开发了用于肌肉内注射和透皮运输 的许多制剂，这些制剂可以用于本发明的实践。rAAV可以与任何 药学上可接受的载剂一起使用，以便于施用和处理。

在本发明的一个实施方案中，本文所述的AAVrh74.MHCK7.微 小肌营养不良蛋白在含有20mM Tris(pH8.0)、1mM氯化镁 (MgCl

将要在本文公开的方法中施用的rAAV的剂量将根据例如特定 的rAAV、施用方式、治疗目标、个体和所靶向的一种或多种细胞 类型而变化，并且可以通过作为本领域标准的方法来确定。所施用 的每种rAAV的滴定度的范围可以为每毫升约1×10

具体而言，本发明的rAAV的实际施用可以通过使用将rAAV 重组载体运输至动物的靶组织的任何物理方法来完成。根据本发明 的施用包括但不限于注射至肌肉内和注射至血流内。仅将rAAV重 悬于磷酸盐缓冲盐水中即展示出足以提供可用于肌肉组织表达的媒 介物，并且对于可以与rAAV共施用的载剂或其他组分没有已知限 制(虽然在使用rAAV的常规方式中应避免降解DNA的组合物)。 可以修饰rAAV的衣壳蛋白，从而使rAAV靶向所关注的特定靶组 织，诸如肌肉。参见例如WO 02/053703，该公开的公开内容以引用 的方式并入本文。药物组合物可以制备为通过透皮运输递送至肌肉 的注射用制剂或局部制剂。此前开发了用于肌肉内注射和透皮运输 的许多制剂，这些制剂可以用于本发明的实践。rAAV可以与任何 药学上可接受的载剂一起使用，以便于施用和处理。

为了进行肌肉内注射，可以采用溶于佐剂(诸如芝麻油或花生 油)或溶于丙二醇水溶液的溶液，以及无菌水溶液。如果需要，此 类水溶液可以是缓冲溶液，并且首先用盐水或葡萄糖对液体稀释剂 进行等渗处理。可以通过在水中与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素) 适当混合来制备作为游离酸(DNA含有酸性磷酸基团)或药理学上 可接受的盐的rAAV的溶液。还可以在甘油、液态聚乙二醇及其混 合物中以及在油中制备rAAV的分散体。在普通储存和使用条件下， 这些制备物含有防腐剂，以防止微生物的生长。就此而言，所采用的无菌水性介质均可通过本领域的技术人员熟知的标准技术容易地 获得。

适用于注射用途的药物载剂、稀释剂或赋形剂包括无菌水溶液 或分散体和用于无菌注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉末剂。 在所有情况下，所述形式均必须是无菌的，并且必须具有易于注射 程度的流动性。它在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须能 够防止微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。载剂可以是含有例 如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等等)、 它们的合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。可以例如通过使 用包衣(诸如卵磷脂)，就分散体而言通过维持所需的粒度，以及 通过使用表面活性剂来维持适当流动性。微生物作用的防止可以通 过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯 酚、山梨酸、硫柳汞等等)来实现。在很多情况下包含等渗剂(例 如糖或氯化钠)将是优选的。注射用组合物的延长吸收可以通过使 用延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。

无菌注射用溶液通过将所需量的rAAV掺入具有上文列举的各 种其他成分的适当溶剂中，然后根据需要进行过滤灭菌来制备。通 常，通过将灭菌活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无 菌媒介物含有基本分散介质和上文列举的所需的其他组分。就用于 制备无菌注射用溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法是真空干燥 和冷冻干燥技术，这些方法从此前的无菌过滤溶液产生活性成分以 及任何另外的所期望的成分的粉末。

使用rAAV的转导也可以在体外进行。在一个实施方案中，所 期望的靶肌肉细胞被从受试者中除去，用rAAV转导并且重新引入 受试者中。或者，可以使用同种或异种肌肉细胞，这些细胞不会在 受试者中产生不适当的免疫应答。

用于将已转导的细胞转导和再转导至受试者中的合适的方法是 本领域已知的。在一个实施方案中，可以通过将rAAV与肌肉细胞， 例如在适当的培养基中组合，并且使用常规技术(诸如Southern印 迹和/或PCR)或通过使用选择性标记来筛选具有所关注的DNA的 那些细胞，从而对细胞进行体外转导。然后已转导的细胞可以配制 成药物组合物，并且通过各种技术(诸如通过肌肉内、静脉内、皮 下和腹膜内注射)或通过使用例如导管注射至平滑肌和心肌来将所 述组合物引入受试者中。

使用本发明的rAAV对细胞进行的转导的结果是微小肌营养不 良蛋白的持续表达。因此，本发明提供了将表达微小肌营养不良蛋 白的rAAV施用/递送至动物(优选地人类)的方法。这些方法包括 使用本发明的一种或多种rAAV来转导组织(包括但不限于组织(诸如肌肉)、器官(诸如肝和大脑)和腺(诸如唾液腺))。转 导可以使用包含组织特异性控制元件的基因盒来进行。例如，本发 明的一个实施方案提供了肌肉特异性控制元件指导的肌肉细胞和肌 肉组织转导方法，所述肌肉特异性控制元件包括但不限于来源于肌 动蛋白和肌球蛋白基因家族，诸如来自myoD基因家族(参见 Weintraub等人,Science,251:761-766(1991))、肌细胞特异性增强 子结合因子MEF-2(Cserjesi and Olson,Mol Cell Biol11:4854-4862 (1991))的那些肌肉特异性控制元件，来源于人骨骼肌肌动蛋白基因(Muscat等人,Mol Cell Biol,7:4089-4099(1987))、心肌肌动蛋白 基因、肌肉肌酸激酶序列元件(参见Johnson等人,Mol Cell Biol, 9:3393-3399(1989))和鼠科动物肌酸激酶增强子(mCK)元件的控 制元件，来源于骨骼肌快缩肌钙蛋白C基因、慢缩心肌肌钙蛋白C 基因和慢缩肌钙蛋白I基因的控制元件：缺氧诱导性核因子 (Semenza等人,Proc Natl AcadSci USA,88:5680-5684(1991))、类 固醇诱导性元件和启动子(包括糖皮质激素应答元件(GRE)) (参见Mader and White,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5603-5607 (1993))以及其他控制元件。

肌肉组织是用于体内DNA递送的有吸引力的靶标，因为它不是 重要器官而且易于获取。本发明设想了来自已转导的肌纤维的微小 肌营养不良蛋白的持续表达。

所谓“肌肉细胞”或“肌肉组织”意指来源于任何类型的肌肉(例 如，骨骼肌和平滑肌，例如来自消化道、膀胱、血管或心脏组织) 的细胞或细胞群。此类肌肉细胞可以是分化的或未分化的，诸如成 肌细胞、肌细胞、肌管、心肌细胞和成心肌细胞。

术语“转导”用于指微小肌营养不良蛋白的编码区至接受者细胞 的体内或体外施用/递送，经由本发明的复制缺陷型rAAV引起接受 者细胞的微小肌营养不良蛋白表达。

因此，本发明提供了将有效剂量(或基本上同时施用的剂量， 或间隔一段时间给予的剂量)的编码微小肌营养不良蛋白的rAAV 施用于有需要的受试者的方法。

以下实施例以说明而非限制方式提供。所描述的数值范围包括 每个范围内的每个整数值的端值在内，并且包括最小和最大所述整 数的端值在内。

实施例

实施例1

A)AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体的产生

AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白质粒含有侧接有AAV2 反向末端重复序列(ITR)的人微小肌营养不良蛋白cDNA表达盒 (参见图1)。微小肌营养不良蛋白构建体的特征在于框内棒状结 构域缺失(R4-R23)，而铰链1、2和4和富含半胱氨酸的结构域仍 然可以产生138kDa蛋白质。微小肌营养不良蛋白(3579bp)的表达 是由MHCK7启动子(792bp)指导的。所述质粒通过从 rAAV.MCK.微小肌营养不良蛋白质粒除去MCK启动子并且插入 MHCK7启动子来构建。在核心启动子后，提供了用于有效转录起 始的53bp内源性小鼠MCK外显子1(非翻译)，然后是SV40晚期 16S/19S剪接信号(150bp)和小型5'UTR(61bp)。内含子和5'UTR来源于质粒pCMVβ(Clontech)。微小肌营养不良蛋白盒在 ATG起始位密码子前具有一个共有序列Kozak，并且具有一个用于 mRNA终止的小型53bp合成多聚A信号。人微小肌营养不良蛋白 盒含有(R4-R23/Δ71-78)结构域，如Harper等人.(Nature Medicine 8,253-261(2002))此前所述。互补DNA是针对人类使用而进行密码 子优化的并且由GenScript(Piscataway,NJ)合成(Mol Ther 18,109- 117(2010))。该载体中包含的唯一病毒序列是AAV2的反向末端重 复序列，这是病毒DNA复制和包装所必需的。微小肌营养不良蛋白 盒具有一个用于mRNA终止的小型53bp合成多聚A信号。

此前研究证实了使用MHCK7启动子的心脏表达(Salva等人Mol Ther 15,320-329(2007))并且AAVrh74实现了骨骼肌、隔膜肌和心 肌表达(Sondergaard等人Annals ofclinical and Transl Neurology 2, 256-270(2015))，图1的构建体的序列被衣壳包裹至AAVrh.74病 毒粒子中。AAVrh.74血清型的分子克隆从恒河猴淋巴结克隆，并且 在Rodino-Klapac等人Journal of Translational medicine 5,45(2007)中 有所讨论。

表1显示了质粒AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白的分子 特征(SEQ ID NO:3)

B)AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体的产生和 编码卡那霉素(Kan)抗性的质粒

MHCK7.μDys.KAN的克隆通过以下步骤实现：从 MHCK7.μDys.AMP质粒分离MHCK7.μDys片段和卡那霉素骨架， 并且使用NEBuilder克隆工作流程使它们退火。MHCK7.μDys片段经由SnaBI限制性酶消化来分离。在37℃下，在1×CutSmart缓冲 液(NEB)和1μL SnaBI中以50μL总反应物进行消化1小时。所得 的片段使用1％琼脂糖凝胶经由电泳分离，电泳在105伏下运行1.5 小时。切下对应于MHCK7.μDys插入物的条带，并且使用凝胶纯化 试剂盒(Macherey-Nagel)进行纯化。所得的片段的DNA浓度为 10ng/μL。在含有1×CutSmart缓冲液(NEB)和1μL XbaI的50μL 反应物中，经由在37℃下XbaI限制性酶消化1小时来分离Kan骨架片段。所得的片段使用1％琼脂糖凝胶经由电泳分离，电泳在105 伏下运行1.5小时。切下对应于Kan骨架的条带，并且经由凝胶纯 化试剂盒(Macherey-Nagel)进行纯化。所得的片段的DNA浓度为 8.1ng/μL。使用NEB Builder克隆工作流程对这两个片段进行退火， 该工作流程能够将具有重叠序列的两个片段连接在一起。按照制造 商的方案，在1×NEBuilderHiFi DNA组合预混物中，以20μL的总 反应体积，使用1:1的MHCK7.μDys与卡那霉素骨架比率，在50℃ 下进行NEBuilder克隆反应15分钟。通过将2.5μL克隆产物添加至 细胞中，然后在冰上放置30分钟，然后在42℃下放置30秒，再在 冰上放置5分钟，从而将所得的克隆转化至

实施例2

杜兴肌营养不良的全身基因递送临床试验

这是针对DMD受试者的使用SEQ ID NO:3的 rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白、核苷酸55-5021进行的单 剂量对照试验。队列A将包括六名年龄为3个月至3岁的受试者， 队列B将包括六名年龄为4岁至7岁的受试者。所有受试者将接受 静脉内微小肌营养不良蛋白载体(2×10

在该研究中，rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白经由外周 臂静脉输注，从而可以达到身体中的所有肌肉。六名年龄为3个月 至3岁的DMD受试者被纳入队列A中，六名年龄为4岁至7岁的 DMD受试者被纳入队列B中。所有受试者均接受静脉内微小肌营养 不良蛋白载体(2×10

受试者在全国儿童医院的儿童重症监护室(PICU)接受超过1 小时的输注。在基因疗法前，在筛选访视时进行肌肉活检。受试者 将进行第二次肌肉活检，以确定在分娩后90天该基因是否允许对缺 失的肌营养不良蛋白进行替换。在基因转移后，应仔细监测患者的任何治疗副作用。该监测包括血液和尿液测试，以及在筛选访视期 间以及在第0、1、7、14、30、60、90和180天以及在第9、12、18、 24、30和36个月的身体检查，以确保基因注射无副作用。

队列A的受试者(n＝6)的年龄在3个月至3岁之间，并且接受 静脉内rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白载体(2×10

队列B的受试者(n＝6)的年龄在4岁至7岁之间，并且接受静 脉内rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白载体(2×10

该研究的纳入标准如下：

·纳入年龄：队列A：年龄为3个月至7岁，队列B：年 龄为4岁-7岁(含)。

·具有移码(缺失或重复)或外显子18至58之间的过早 终止密码子突变的DMD基因的分子表征。

·CK升高>1000U/L

·队列A受试者：在针对大幅运动的Bayley-III运动评估 中小于平均值被定义为量表分数≤9

·队列B：在100米计时测试中小于平均值被定义为<预测 的80％

·任何种族的男性。

·能够与运动评估测试协作。

·队列A受试者：此前未使用皮质类固醇治疗。

·队列B受试者：在筛选前至少12周口服皮质类固醇的 稳定剂量当量，并且在整个研究中，预期剂量保持恒定(除适应体 重变化的调整之外)。

该研究的排除标准如下：

·基于临床观察的活性病毒感染。

·心肌病的体征，包括射血分数小于40％的超声心动图。

·HIV感染、或者乙肝或丙肝感染的血清学证据。

·自身免疫疾病的诊断(或正在进行的治疗)。

·异常实验室值被认为具有临床显著性。

·PI认为，伴随疾病或对慢性药物治疗的需要会给基因转 移带来不必要的风险。

·通过ELISA免疫测定法确定的AAVrh74或AAV8抗体 滴定度>1:400的受试者。

·研究者认为，医学病症或缓解情况可以损害受试者遵守 方案所要求的测试或程序的能力，或者损害受试者的健康、安全性 或临床可解释性。

·在基因转移访视前4周内发生严重感染(例如，肺炎、 肾盂肾炎或脑脊髓膜炎)(纳入可能推迟)。

·在针对该研究的筛选前的最近6个月内，接受任何研究 药物(除皮质类固醇之外)或外显子跳跃药物(包括

·已经进行任何类型的基因疗法、基于细胞的疗法(例如 干细胞移植)或CRISPR/Cas9疗法。

·家庭不希望向初级保健医生和其他医疗提供者公开患者 的研究参与情况。

主要结局指标是基于发生不良事件的参与者的数量的安全性 (时间范围：3年)。监测不良反应，并且对研究项目的严重性和 相关性进行评分。

次要结局指标如下：

大幅运动子测试量表(Bayley-III)分数(时间范围：筛选，第 30天-3年)：大幅运动量表分数测量运动发展。从第30天至3年， 每次随访都对队列A进行Bayley-III大幅运动子测试评分。在筛选 时，与年龄为42个月的儿童的标准数据相比，年龄为43-47个月(含)的任何受试者均具有计算量表分数。Bayley-III提供了年龄为 1-42个月的儿童的标准数据。

物理疗法评估100米计时测试(100m)(时间范围：筛选，第 30天-3年)：100m是队列B的主要运动结局。100米计时测试是在 儿童3岁时针对队列A的起始探索性结局。

物理疗法评估北极星移动评估量表(NSAA)(时间范围：筛 选，第30天-3年)：北极星移动评估量表(NSAA)是在儿童四岁 时针对队列A和针对队列B的起始探索性结局。NSAA测量患有杜 兴肌营养不良的年轻男孩的行走质量。

物理疗法评估针对儿童而修改的计时起立-行走(TUG)(时间 范围：筛选，第30天-3年)：队列B的探索性结局包括针对儿童而 修改的计时起立-行走(TUG)。

物理疗法评估上升和下降4梯(时间范围：筛选，第30天-3 年)：队列B的探索性结局将包括上升和下降4梯。

物理疗法评估手持式肌力测定(HHD)(时间范围：筛选，第 30天-3年)：队列B的探索性结局包括膝伸肌和膝屈肌以及肘屈肌 和肘伸肌的手持式肌力测定(HHD)。

通过免疫荧光进行的微小肌营养不良蛋白基因表达定量(时间 范围：筛选，第90天)：微小肌营养不良蛋白基因表达水平通过免 疫荧光来定量，并且在肌肉活检前后进行比较。

通过蛋白质印迹进行的微小肌营养不良蛋白基因表达定量(时 间范围：筛选，第90天)：微小肌营养不良蛋白基因表达水平通过 蛋白质印迹分析来定量，并且在肌肉活检前后进行比较。

在基因疗法后CK的减少(时间范围：3年)：在循环血液中 CK水平的减少。

心脏磁共振成像(1年)。

经由免疫荧光(IF)纤维强度对微小肌营养不良蛋白表达相对 于基线的变化进行分析和定量。如图7所示，在rAAVrh74.MHCK7. 微小肌营养不良蛋白的施用后，受试者1(5岁)展示出在腓肠肌活 检的肌纤维中微小肌营养不良蛋白的表达为78％，在rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白的施用后，受试者2(4岁) 展示出在腓肠肌活检的肌纤维中微小肌营养不良蛋白的表达为 73.5％，在rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白的施用后，受试 者3(6岁)展示出在腓肠肌活检的肌纤维中微小肌营养不良蛋白的 表达为77.0％。在rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白的施用后， 受试者4(4岁)展示出在腓肠肌活检的肌纤维中微小肌营养不良蛋 白的表达为96.2％。所有患者均显示出已转导的微小肌营养不良蛋 白的强表达，所述微小肌营养不良蛋白适当地定位于肌肉肌膜中， 如通过免疫组织化学所测量。与正常对照相比，如通过微小肌营养 不良蛋白阳性纤维的百分数所测量，平均基因表达为76.2％，平均 纤维强度为74.5％。

还通过定量微小肌营养不良蛋白表达来评估从基线至第60天的 微小肌营养不良蛋白基因表达的变化，如通过活检肌肉组织的蛋白 质印迹所测量。如图8A和8B所示，蛋白质印迹分析检测到受试者 1(5岁)、受试者2(4岁)和受试者3(6岁)中的微小肌营养不 良蛋白表达。图8C提供了检测受试者4(4岁)中的微小肌营养不 良蛋白表达的蛋白质印迹分析。如通过蛋白质印迹所测量，所有治 疗后活检样品均显示出微小肌营养不良蛋白的高水平，受试者1-4 的平均值，与采用方法1的正常值相比为74.3％，与根据方法2(针 对脂肪和纤维化组织进行调整)的正常值相比为95.8％。

对于每名受试者，测量每个肌纤维的细胞核的载体基因组拷贝。 如表2所示，在rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白的施用后， 对于每名受试者，每个核酸酶的载体基因组拷贝均大于1。一个拷 贝的载体表示大约50％的微小肌营养不良蛋白基因表达。在受试者 1-3中测量的每个细胞核的载体拷贝平均值为1.6，这与所观察的高 微小肌营养不良蛋白表达水平一致。当纳入受试者4的值时，平均 载体拷贝/μg DNA>10

表2

在rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白的施用前和施用后， 通过免疫组织化学来测量肌肉活检组织中的α-肌聚糖和β-肌聚糖的 蛋白质水平。rAAVrh74.MHCK7的施用还引起受试者中的DAPC蛋 白的上调。如图9所示，在受试者1(图9A)、受试者2(图9B) 和受试者3(图9C)中，在rAAVrh74.MHCK7的施用前，肌肉活 检组织中的α-肌聚糖和β-肌聚糖的表达，与肌肉活检样品中的这些 蛋白质的水平相比有所增加。

在rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白载体(2×10

表4和图10提供了每名受试者的CK水平。图11提供了随时 间推移的平均CK水平，并且展示出在rAAVrh74.MHCK7.微小肌营 养不良蛋白的施用后，平均CK水平随时间推移显著减少。 27,064U/L的平均基线CK水平(表3的平均值)减少约63％，达到 9,982U/L的平均值(平均值，第270天，表4)。

表3

表4：从基线至第270天的CK水平变化

除微小肌营养不良蛋白和CK水平之外，还通过以下功能测试 来测量功效：从地面起立时间、上升4梯、北极星移动评估量表 (NSAA)、起立时间测试、上升4梯测试、10米计时测试(10m) 和100米计时测试(100m)。数据提供于下表5和6中，并且该数 据展示出在rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白的施用后9个月 的持续、持久改善。图12还提供了随时间推移的NSAA改善。

表5：从基线至第270天的NSAA变化

表6：从基线至第270天的变化

在研究中未观察到严重不良事件(SAE)。三名受试者的γ-谷 氨酰转移酶(GGT)升高，这可通过在一周内的类固醇增加而缓解， 并且恢复基线水平。未观察到其他临床显著性实验室发现。患者通 常在治疗的第一周出现短暂恶心，同时类固醇剂量增加。这与肝酶升高或任何其他异常无关。

实施例3

随机双盲安慰剂对照的全身基因递送I/IIa期临床试验

这是针对DMD受试者的使用rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不 良蛋白进行的随机双盲单剂量试验。该研究包括二十四名年龄为4 岁至7岁的受试者。在纳入时将受试者随机分组至治疗组或安慰剂 组。十二名受试者接受静脉内rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白载体(2×10

该研究的主要目的是评估针对DMD受试者经由外周肢静脉的 rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白的静脉内施用的安全性。通 过血液学、血清化学、尿液分析、对rAAVrh74和微小肌营养不良 蛋白的免疫应答、以及报告病史和症状观察的变化来评估安全性终点。肌营养不良蛋白基因表达与安全性一起作为主要结局指标。使 用经验证的免疫荧光和免疫印迹测定法来进行定量。基因疗法后的 CK减少作为次要结局。功效通过以下功能测试来测量：起立时间、 上升4梯、北极星移动评估量表(NSAA)、10米计时测试(10m)、 100米计时测试(100m)。探索性指标包括膝伸肌和膝屈肌以及肘 屈肌和肘伸肌的手持式肌力测定(HHD)。

该研究的纳入标准如下：

·纳入年龄：年龄在4岁-7岁(含)之间。

·具有移码(缺失或重复)或外显子18至58之间的过早 终止密码子突变的DMD基因的分子表征。

·症状性肌营养不良的适应症：CK升高>1000U/L并且在 100米步行测试中小于预测时间的平均值百分比

·任何种族的男性均符合纳入资格。

·能够与运动评估测试协作。

·在筛选前至少12周口服皮质类固醇的稳定剂量当量，并 且在整个研究中，预期剂量保持恒定(除适应体重变化的潜在调整 之外)。

该研究的排除标准如下：

·基于临床观察的活性病毒感染。

·心肌病的体征，包括射血分数小于40％的超声心动图。

·HIV感染、或者乙肝或丙肝感染的血清学证据。

·自身免疫疾病的诊断(或正在进行的治疗)。

·异常实验室值被认为具有临床显著性(GGT>3XULN、 胆红素≥3.0mg/dL、肌酐≥1.8mg/dL、Hgb<8或>18g/Dl； WBC>18,500/cmm)，血小板≤50,000。

·PI认为，伴随疾病或对慢性药物治疗的需要会给基因转 移带来不必要的风险。

·通过ELISA免疫测定法确定的AAVrh74或AAV8抗体 滴定度>1:400的受试者。如果在筛选时终点滴定度为正，则可以在 排除前重复测试。

·研究者认为，具有医学病症或缓解情况，这些医学病症 或缓解情况可以损害受试者遵守方案所要求的测试或程序的能力， 或者损害受试者的健康、安全性或临床可解释性。

·在基因转移访视前4周内发生严重感染(例如，肺炎、 肾盂肾炎或脑脊髓膜炎)(纳入可能推迟)。

·在针对该研究的筛选前的最近6个月内，已经接受任何 研究药物(除皮质类固醇之外)或外显子跳跃药物(包括

·已经进行任何类型的基因疗法、基于细胞的疗法(例如 干细胞移植)或CRISPR/Cas9疗法。

·家庭不希望向初级保健医生和其他医疗提供者公开患者 的研究参与情况。

肌营养不良蛋白基因表达与安全性一起作为主要结局指标。使 用经验证的免疫荧光和免疫印迹测定法来进行定量。基因疗法后的 CK减少作为次要结局。此外，功效通过以下功能测试来测量：从地 面起立时间、上升4梯、北极星移动评估量表(NSAA)、10米计 时测试(10m)、100米计时测试(100m)。探索性指标包括膝伸 肌和膝屈肌以及肘屈肌和肘伸肌的手持式肌力测定(HHD)。

超声引导下的肌肉活检被用于进行比较基线与第90天的转基因 表达定量。对与原始活检相同、但是在另一条腿上的肌肉进行活检。 在一年后对所有受试者进行给药，安慰剂交叉受试者将在访视1时 重新开始研究时间表。安慰剂受试者在第二次基线筛选时将不会进 行以下操作：心脏MRI和肌肉活检。安慰剂受试者在第90天接受 肌肉活检(总共3次肌肉活检)。使用间接免疫荧光(IF)对冷冻 切片进行肌营养不良蛋白染色。使用经验证的图像扫描和 MuscleMapTM分析算法进行全玻片扫描，并且对微小肌营养不良蛋 白强度和阳性纤维百分比进行定量。通过盲法进行肌肉形态测量， 包括纤维尺寸直方图。使用经验证的蛋白质印迹方法，将盲法冷冻 肌肉活检刮拭物用于进行针对微小肌营养不良蛋白的定量蛋白质分 析。

腓肠肌的肌肉针刺活检(除非PI认为在特定受试者中是禁忌的， 在这种情况下PI将选择替代性肌肉进行活检)被用于定量微小肌营 养不良蛋白表达。

主要功效终点是微小肌营养不良蛋白表达的数量从基线至第90 天的变化，如通过活检肌肉组织的蛋白质印迹所测量。主要功效终 点的治疗组差异通过协方差分析(ANCOVA)模型来评估，其中治 疗是固定因子，基线值是协变量。威尔科克森(Wilcoxon)秩和检 验作为支持性分析进行。类似地，经由免疫荧光(IF)纤维强度对 微小肌营养不良蛋白表达相对于基线的变化进行分析。

支持性功效终点包括从地面起立时间、上升4梯、NSAA、10米 计时测试(10m)、100米计时测试(100m)和CK变化的从基线至 每次预定评估的变化。探索性指标包括膝伸肌和膝屈肌以及肘屈肌 和肘伸肌的HHD。治疗组差异通过ANCOVA模型来评估，其中治疗 是固定因子，基线值是协变量。威尔科克森秩和检验作为支持性分 析进行。

实施例4

上文实施例2和实施例3中所述的试验和研究可以替代性地采 用SEQ ID NO:9所示的rAAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构 建体；SEQ ID NO:8所示的核苷酸1-4977；或SEQ ID NO:6所示的 核苷酸56-5022来进行。

实施例5

pAAV.MCK.微小肌营养不良蛋白构建体的产生

通过将驱动密码子优化的人微小肌营养不良蛋白cDNA序列的 MCK表达盒插入AAV克隆载体psub201中来构建pAAV.MCK.微小 肌营养不良蛋白质粒(Samulski等人,J.Virol.61(10):3096-3101)。肌 肉特异性调控元件被包括在构建体中以驱动肌肉特异性基因表达。 该调控元件包含融合至351bp MCK核心启动子(近端)的小鼠 MCK核心增强子(206bp)。在核心启动子后，所述构建体包含用 于有效转录起始的53bp内源性小鼠MCK外显子1(非翻译)，然 后是SV40晚期16S/19S剪接信号(97bp)和小型5'UTR(61bp)。 内含子和5'UTR来源于质粒pCMVβ(Clontech)。微小肌营养不良 蛋白盒在ATG起始位密码子前具有一个共有序列Kozak，并且具有 一个用于mRNA终止的小型53bp合成多聚A信号。人微小肌营养不良蛋白盒含有(R4-R23/Δ71-78)结构域，如Harper等人Nat.Med. 8(3):253-61,2002此前所述。

pAAV.MCK.微小肌营养不良蛋白质粒含有侧接有AAV2反向末 端重复序列(ITR)的人微小肌营养不良蛋白cDNA表达盒(参见图 5)。该序列被衣壳包裹成AAVrh.74病毒粒子。AAVrh.74血清型的 分子克隆从恒河猴淋巴结克隆，并且在Rodino-Klapac等人.Journalof Tran.Med.45(2007)中有所描述。

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