玄参药材评价模型的构建方法和玄参药材品质的评价方法

摘要

本发明涉及一种玄参药材评价模型的构建方法和玄参药材品质的评价方法。所述玄参药材评价模型的构建方法包括以下步骤：测定玄参药材中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的含量；获取所述玄参药材的物理特征参数；建立玄参药材的物理特征参数一与哈巴苷和哈巴俄苷的含量之和的回归方程一；建立玄参药材的物理特征参数二与肉桂酸含量的回归方程二。将玄参药材的物理特征参数与玄参药材中多种指标活性成分含量结合评价，可以更客观、准确、高效、全面地评价玄参药材品质。

说明书

技术领域

本发明涉及药材检测技术领域，特别涉及玄参药材评价模型的构建方法和玄参药材品质的评价方法。

背景技术

玄参为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl的干燥根。味甘、苦、咸，微寒，具有清热凉血，滋阴降火，解毒散结功效。用于热入营血，温毒发斑，热病伤阴，舌绛烦渴，津伤便秘，骨蒸劳嗽，目赤，咽痛，白喉，療疬等症。研究表明，玄参主要化学活性成分为环烯醚萜苷类(哈巴苷、哈巴俄苷)、有机酸类(肉桂酸)等，具有抗炎、保肝、抗血栓、抗菌等作用。

现今中药品质评价方法主要为性状鉴别经验法或者化学成分含量测定法。其中，性状鉴别是鉴定中药真伪优劣的重要手段之一，具有简便、直观、快速特点，包括观察性状、大小、颜色、质地等方面。但传统性状鉴别主要以人工评价为主，对药工的经验积累要求较高，难以传承和发展，不利于企业规范化生产，还存在主观性强、准确性和重现性差的缺点，缺乏客观评价量化指标及现代科学技术的支撑。化学成分含量测定法主要照搬化学药质量控制模式而“唯成分论”的误区，忽略了中药传统质量控制指标“形、色、气、味”的精髓。目前，上述两种中药品质评价方法均存在局限性。

发明内容

基于此，本发明提供一种玄参药材评价模型的构建方法和玄参药材品质的评价方法。将玄参药材的物理特征参数与玄参药材中多种指标活性成分含量结合评价，可以更客观、准确、高效、全面地评价玄参药材品质。

所述玄参药材评价模型的构建方法包括以下步骤：

测定玄参药材中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的含量；

获取所述玄参药材的物理特征参数；

将所述玄参药材的物理特征参数与所述哈巴苷和哈巴俄苷的含量之和进行相关性分析和回归分析，筛选出与哈巴苷和哈巴俄苷的含量之和相关性好、且回归方程有统计学意义的玄参药材的物理特征参数一，建立玄参药材的物理特征参数一与哈巴苷和哈巴俄苷的含量之和的回归方程一；

将所述玄参药材的物理特征参数与所述肉桂酸含量进行相关性分析和回归分析，筛选出与肉桂酸含量相关性好、且回归方程有统计学意义的玄参药材的物理特征参数二，建立玄参药材的物理特征参数二与肉桂酸含量的回归方程二。

在其中一个实施例中，所述玄参药材的物理特征参数包括粉碎前的玄参药材的形态特征参数、粉碎前的玄参药材的外部颜色特征参数和粉碎后的玄参药材的内部颜色特征参数；

所述形态特征参数包括长轴、短轴、周长、面积、直径、离心率、矩形度、长短轴比和圆形度；

所述外部颜色特征参数包括色度值L

所述内部颜色特征参数包括色度值L

在其中一个实施例中，通过对粉碎前后的玄参药材进行图像采集，然后利用MatLab软件，获取所述玄参药材的物理特征参数。

在其中一个实施例中，获取粉碎前的玄参药材的形态特征参数的步骤包括：

对粉碎前的所述玄参药材进行图像采集，利用MatLab软件，通过函数rgb2gray和函数im2bw实现对采集到的图像的阈值分割；

再通过函数bwlabel和函数regionprops实现对阈值分割后的所述图像的分析，提取粉碎前的玄参药材的形态特征参数。

在其中一个实施例中，获取粉碎前的玄参药材的外部颜色特征参数的步骤包括：

对粉碎前的所述玄参药材进行图像采集，利用MatLab软件，将采集到的图像的RGB空间模型转化为CIELab颜色空间模型，提取色度值L

在其中一个实施例中，获取粉碎后的玄参药材的内部颜色特征参数的步骤包括：

对粉碎后的所述玄参药材进行图像采集，利用MatLab软件，将采集到的图像的RGB空间模型转化为CIELab颜色空间模型，提取色度值L

在其中一个实施例中，所述玄参药材的物理特征参数一为色度值a

在其中一个实施例中，所述玄参药材的物理特征参数二为直径，所述回归方程二为Y

在其中一个实施例中，所述相关性分析为SPSS Pearson相关性分析；所述回归分析为逐步回归分析。

在其中一个实施例中，测定玄参药材中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的含量的方法包括以下步骤：

分别制备哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的混合对照品溶液和玄参药材的待测样品溶液；

对所述混合对照品溶液和待测样品溶液进行超高效液相色谱测定；

所述超高效液相色谱的色谱条件包括：

以乙腈为流动相A，以体积分数为0.1±0.05％的磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；柱温为30±2℃；前13.5min的检测波长为210±2nm，13.5min后的检测波长为278±2nm；流速为0.3±0.02mL/min；进样量为1±0.5μL。

在其中一个实施例中，所述梯度洗脱具体为：

0～5min，所述流动相A的体积分数由0％上升至10％；5～7min，所述流动相A的体积分数由10％上升至20％；7～9min，所述流动相A的体积分数由20％上升至33％；9～12min，所述流动相A的体积分数保持33％；12～16min，所述流动相A的体积分数由33％上升至60％；16～20min，所述流动相A的体积分数由60％上升至80％；20～24min，所述流动相A的体积分数由80％上升至95％。

所述玄参药材品质的评价方法包括以下步骤：

根据上述回归方程一和回归方程二，代入待测玄参药材的物理特征参数一和物理特征参数二，计算待测玄参药材中哈巴苷和哈巴俄苷的含量之和以及待测玄参药材中肉挂酸含量；

当所述待测玄参药材中哈巴苷和哈巴俄苷的含量之和≥0.45％，且所述待测玄参药材中肉挂酸含量≥0.01％时，判断所述待测玄参药材的品质为合格。

目前《中国药典》仅收载了哈巴苷、哈巴俄苷的含量测定方法，规定哈巴苷和哈巴俄苷总质量不得低于玄参药材质量0.45％，忽视了对其它活性成分的检测，不能准确地评价玄参的产品质量和疗效，故本发明增加测定玄参肉桂酸含量，以进一步增加对玄参质量控制的专属性，并选取肉桂酸含量的下限为0.01％。

与现有方案相比，本发明具有以下有益效果：

本发明将玄参药材的物理特征参数与玄参药材中多种指标活性成分(哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸)含量结合，构建了玄参药材评价模型，为玄参品质评价提供新的鉴定方法。本发明的玄参药材品质的评价方法，仅需通过获取粉碎前的待测玄参药材的直径和粉碎后的待测玄参药材的色度值a

此外，相对于现有的人工测量方式定量化，本发明通过对粉碎前后的玄参药材进行图像采集，然后利用MatLab软件获取粉碎前后的玄参药材的物理特征参数，在效率和精度方面可以更加理想。

附图说明

图1为原图像(左)和转化后的二值化图像(右)；

图2混合对照品溶液(A)和玄参样品供试品(B)的UPLC图(1：哈巴苷；2：哈巴俄苷；3：肉桂酸)。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明中，“含量”可以理解为质量，也可以理解为质量百分比，即哈巴苷和哈巴俄苷的含量之和可以理解为哈巴苷和哈巴俄苷的总质量百分比。

本发明中，“相关性好”可以理解为相关性分析中，相关性系数|r|≥0.3，且呈现出在0.05或者0.01水平(双侧)上的显著性，并比其他特征参数相关系数|r|值较高。

本发明中，“回归方程有统计学意义”可以理解为利用方差分析对回归方程进行显著性检验，F值对应的Sig.值小于0.05就可以认为回归方程是有用的。

1仪器与材料

Thermo Vanquish型超高效液相色谱仪(Thermo公司)，TUV检测器(Thermo公司)，Thermo工作站；ME204E型万分之一天平(Mettler Toledo公司)；XP26型百万分之一天平(Mettler Toledo公司)；111B型二两装高速中药粉碎机(浙江瑞安市永历制药机械有限公司)；数控KQ-500DE型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；MiliQ Direct 8型超纯水机(默克密理博公司)。数码相机(佳能80D，2400万像素)，MatLab R2014a。

哈巴苷(质量分数≥96.8％，批号111729-201707)，哈巴俄苷(质量分数≥96.0％，批号111730-201508)，肉桂酸(质量分数≥98.8％，批号1110786-201604)对照品均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯(默克公司)，磷酸为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2样品收集

玄参药材为市场收集，来自湖北、浙江、安徽、四川、河南等地，经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl的干燥根。

3图像采集

从每批(XC-1～XC-40)玄参药材中随机抽取数根，置于密闭光照箱里白色背景上，相机与玄参保持15cm距离，摄取图像。

4获取粉碎前后的所述玄参药材的物理特征参数

4.1获取粉碎前的玄参药材的形态特征参数

对项3下摄取的图像，应用MatLab数字图像处理工具箱中自带函数rgb2gray和im2bw，完成二值图像转换，即实现背景与目标物分割(阈值分割)，例如图1所示。

应用MatLab软件自带函数bwlabel和regionprops，对二值图像目标物实现标注、测量，计算形态特征参数：长轴、短轴、周长、面积、直径、离心率(为与目标区域有相同二阶矩的椭圆的离心率)、矩形度(为目标区域面积与其最小外接矩形的面积的比值)、长短轴比、圆形度。结果见表1(以像素为单位)。

表1 形态特征参数测定结果

4.2获取粉碎前的玄参药材的外部颜色特征参数

对项3下摄取的图像，应用MatLab软件将图像RGB空间模型转化为CIE Lab颜色空间模型，提取外部颜色特征参数的均值：色度值L

4.3获取粉碎后的玄参药材的内部颜色特征参数

将上述随机抽取到的玄参样品粉碎，粉碎后过三号筛，混合均匀，采用与项3相同的方法，对粉碎后的玄参药材粉末进行图像采集，利用MatLab软件，将采集到的图像的RGB空间模型转化为CIELab颜色空间模型，测定内部颜色特征参数的均值：色度值L

表2 内外部颜色特征参数测定结果

5测定玄参药材中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的含量

5.1色谱条件：YMC Triart C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.9μm)；以乙腈(A)-0.1％磷酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～5min，0％～10％A；5～7min；10％～20％A；7～9min，20％～33％A；9～12min，33％A；12～16min，33％～60％A；16～20min；60％～80％A；20～24min；80％～95％A)；柱温30℃；检测波长：前13.5min为210nm，13.5min后改为278nm；流速0.3mL/min，进样量1μL。在此色谱条件下，对照品溶液和供试品溶液中哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸3种成分的分离均良好，色谱图见图2。

5.2对照品溶液的制备：取哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成浓度分别为66.598 4μg/mL、60.844 8μg/mL、21.271 6μg/mL的混合对照品溶液。

5.3供试品溶液的制备：取样品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率45kHz)30min，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

5.4线性关系考察：精密称定哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸对照品适量，加50％甲醇制成浓度分别为665.984 0μg/mL、608.448 0μg/mL、425.432 8μg/mL的对照品贮备液。分别加50％甲醇稀释制得7个不同质量浓度的对照品溶液，以质量浓度(μg/mL)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，各个对照品的线性关系良好，结果见表3。

表3 回归方程及线性范围

5.5精密度试验：取混合对照品溶液，按“5.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算得到哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸峰面积的RSD分别为0.17％、0.14％、0.10％，表明仪器精密度良好。

5.6重复性试验：取同一批玄参粉末6份，精密称定，按“5.3”项下方法制备供试品溶液，按“5.1”项下色谱条件分别进行测定，计算得到哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸含量RSD分别为1.13％、1.96％、0.84％，表明方法重复性良好。

5.7稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，按“5.1”项下色谱条件，分别在0、3、7、12、18、24h进样测定，记录峰面积，计算得到哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸峰面积的RSD分别为1.21％、1.02％、0.96％，表明供试品溶液在24h内稳定。

5.8加样回收率试验：取已测定含量的样品约0.25g，共6份，精密称定，分别精密加入一定量的对照品，按“5.3”项下方法制备供试品溶液，按“5.1”项下色谱条件分别进行测定，哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸的平均回收率分别为94.83％、100.63％、93.90％，RSD分别为1.28％、1.40％、1.76％，结果见表4，表明回收率良好。

表4 加样回收率实验结果

5.9样品测定：按“5.3”项下的方法制备供试品溶液，按“5.1”项下的色谱条件测定样品中的哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸含量，并求得哈巴苷和哈巴俄苷总质量百分数和肉桂酸质量百分数。结果见表5。根据表5，拟定肉桂酸质量百分数不得低于0.01％。

表5成分测定结果

6相关性分析和回归分析

6.1Pearson相关性分析：运用SPSS 20.0软件中Pearson相关分析，对上述玄参药材的物理特征参数(粉碎前的玄参药材的形态特征参数、粉碎前的玄参药材的外部颜色特征参数和粉碎后的玄参药材的内部颜色特征参数)与上述哈巴苷和哈巴俄苷总质量百分数和肉桂酸质量百分数的数据分别进行相关性分析。结果见表6～7。结果显示：哈巴苷和哈巴俄苷总质量百分数与内部颜色色度值(a

表6 相关性统计分析结果(形态)

表7 相关性统计分析结果(颜色)

注:*在0.05水平(双侧)上显著相关；**在0.01水平(双侧)上显著相关。

6.2回归分析：以上述玄参药材的物理特征参数(粉碎前的玄参药材的形态特征参数、粉碎前的玄参药材的外部颜色特征参数和粉碎后的玄参药材的内部颜色特征参数)为自变量，分别以主要成分含量(哈巴苷和哈巴俄苷总质量百分数、肉桂酸质量百分数)为因变量，用SPSS 20.0中逐步回归法，对其进行回归分析。此方法可以自动剔除对因变量影响小的自变量。得到模型1、2，即回归方程一和回归方程二。回归分析结果见表8～9。从表8可看出，哈巴苷和哈巴俄苷总质量百分数主要受粉碎后的玄参药材的内部颜色色度值a

表8 回归分析结果

表9 回归系数结果

实施例1

本实施例提供一种玄参药材品质的评价方法，应用所建立的色度值a

对未用于建模，且符合药典标准的8批(XC-41～XC-48)玄参药材及2批(XC-49～XC-50)含量不符合药典标准要求的玄参样品进行验证，得到的鉴定结果见表10，检测效率见表11。

表10 鉴定结果

根据要求：如果哈巴苷和哈巴俄苷总质量百分数不低于0.45％，且肉桂酸质量百分数不低于0.01％，则判断玄参药材的品质为合格。由上表可知，样品XC-41～XC-48均符合标准要求，均可准确鉴定为合格品，不合格样品XC-50可被鉴定为不合格品，而只有XC-49样品被误判为合格品，误判率为10％。说明所建立的模型相对稳定可靠，可用于预判鉴别玄参药材质量。

对比例1

本对比例提供一种玄参药材品质的评价方法，取与实施例1相同的(XC-41～XC-48)玄参药材，采用传统经验性状鉴别法，判断是否符合标准要求。检测效果和效率见表11。

对比例2

本对比例提供一种玄参药材品质的评价方法，取与实施例1相同的(XC-41～XC-48)玄参药材，采用UPLC法测定玄参样品的哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸含量，并计算哈巴苷和哈巴俄苷的总质量百分数和肉桂酸质量百分数。即仅采用含量测定法评价。检测效果和效率见表11。

表11 检测效果和效率

由上表可知，对比例1仅采用传统经验性状鉴别法评价，所用时长最少，但误判率为20％；实施例1采用玄参药材的物理特征参数与多指标成分含量构建的模型综合评价，时长次之，误判率为10％；对比例2仅采用含量测定法，误判率虽然为0，但所用时长最多。综合考虑，故采用本发明评价模型的综合评价法，能快速、客观、准确，更利于整体全面评价玄参质量。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。