一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin4-23及其应用

摘要

本发明公开了一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin4‑23及其应用，该抗菌肽的分子式为C94H154N41O27S1，氨基酸序列为SEQ ID NO.01。本发明的拟穴青蟹抗菌肽Spamprin4‑23，具有较强的抗细菌活性及抗真菌活性，抗菌效果好，抗菌谱广，杀菌速率快，其来源于甲壳动物，可作为有效成分应用于水产饲料添加剂、防霉防腐药物、抗菌药物之中，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于海洋分子生物学技术领域，具体涉及一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

背景技术

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)，简称青蟹，是我国东南沿海重要的经济养殖蟹类。青蟹早期发育阶段尤其是幼龄期可能存在一段“危险期”，即母源抗性因子的耗尽而青蟹幼体自身免疫功能还未健全，此时青蟹幼体与自然环境中众多的微生物接触，容易受到外界微生物的侵染而导致大量死亡。故青蟹幼体阶段是其存活的关键阶段，在此阶段机体的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRRs)与病原菌表面相关分子结合，促进抗菌肽的合成，来防御病原微生物的入侵。抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)也称为天然抗生素，是生物体内天然存在的具有抗菌活性的小分子肽，是虾、蟹、贝类等无脊椎动物先天性免疫系统中的重要效应分子，在抵抗病原微生物感染方面发挥着至关重要的作用。故本实验通过LPS和解藻弧菌分别对青蟹幼体阶段进行人工感染，观察青蟹早期不同发育阶段相应的免疫应答变化，从转录组数据库中筛选未知免疫相关因子，从蛋白水平上鉴定其免疫方面的功能。

抗菌肽是一类广泛存在于自然界生物体中的小分子肽物质。其中大部分属于阳离子抗菌肽，只有少部分属于阴离子抗菌肽。尽管抗菌肽的长度、氨基酸组成和二级结构各不相同，但其都具有适合与膜结合的两亲性结构。抗菌肽在生物体内，除了具有抗菌功能外，还能够通过不同的途径调节机体的免疫反应，因此它们是机体先天性免疫系统中的重要组分。由于抗菌肽可以通过使用多种机理杀灭微生物，不易使病原菌产生耐药性，所以它们被视为抗生素的最佳替代品。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

本发明的技术方案之一是：提供了一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

Ala-His-Cys-Gln-Thr-Arg-Arg-Thr-Ala-Ser-Ser-Pro-Arg-Trp-Ser-Arg-His-Arg-Gly-Ala

(SEQ ID NO.01)。

本发明的技术方案之二是：提供了上述的一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

本发明的技术方案之三是：提供了一种抗菌药物，其有效成分包括拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

本发明的技术方案之四是：提供了一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

本发明的技术方案之五是：提供了一种防霉防腐药物，其有效成分包括拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

本发明的技术方案之六是：提供了一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

本发明的技术方案之七是：提供了一种水产饲料添加剂，其有效成分包括拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

1.本发明的拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

2、本发明的拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

3、本发明的拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

附图说明

图1为拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

图2至图4为拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

图5为拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

图6为拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

图7为MTS-PMS法检测拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

具体实施方式

实施例1

本实施例一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

Ala-His-Cys-Gln-Thr-Arg-Arg-Thr-Ala-Ser-Ser-Pro-Arg-Trp-Ser-Arg-His-Arg-Gly-Ala

(SEQ ID NO：01)。

采用现有的固相化学合成的方法即可得到纯度达95％以上拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

抗菌肽Spamprin

表1抗菌肽Spamprin

由表1可知Spamprin

一、拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

所涉及到的菌株有：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、腐皮镰孢(Fusarium solani)。菌株均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，由本实验室保种贮藏。

具体方法如下：

(1)将保种的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、溶壁微球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、施氏假单胞菌、弗氏志贺氏菌、荧光假单胞菌涂布于营养肉汤平板上，在各适宜温度倒置培养18-24h；新型隐球菌涂布于YPD平板上，于28℃倒置培养1-3d；尖孢镰孢、烟曲霉、赭曲霉、腐皮镰孢孢子涂布于马铃薯葡萄糖平板上，于28℃倒置培养3-7d。

(2)从各平板上挑取菌落接种于相应的培养基斜面上，细菌继续培养18-24h，酵母真菌继续培养1-3d，霉菌继续培养3-7d。用10mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.4)将细菌、弧菌和酵母真菌从斜面上冲下，调整菌悬液浓度。用MH液体培养基和磷酸钠缓冲液混合液稀释细菌；用YPD液体培养基和磷酸钠缓冲液混合液稀释酵母真菌。用10mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.4)将霉菌孢子从斜面上冲下，用马铃薯葡萄糖液体培养基和磷酸钠缓冲液混合液稀释孢子，利用血球计数板在光学显微镜下对孢子计数，调整孢子浓度，使得霉菌孢子最终浓度为5×10

(3)将已合成的Spamprin

(4)在96孔细胞培养板上，每种待测菌设置空白对照组、阴性对照组和待测实验组，每组设置三个平行：

a空白对照组：50μL待测蛋白样品和50μL培养基

b阴性对照组：50μL无菌Milli-Q水和50μL菌悬液

c待测实验组：50μL待测蛋白样品和50μL菌悬液

(5)将96孔细胞培养板置于28℃培养箱中，培养1-2d，观察待测实验组中MIC结果；将待测实验组吹打混匀后，吸取适量的菌液滴于相应固体培养基平板上，于适宜温度倒置培养1-2d，观察MBC结果。

拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

表2拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

注：MIC：最小抑菌浓度(μM)，用a-b表示。a：肉眼可见菌体生长的最高蛋白浓度；b：肉眼未见菌体生长的最低蛋白浓度

MBC：最小杀菌浓度(μM)，用a-b表示。a：平板可见菌落生长的最高蛋白浓度；b：平板未见菌落生长的最低蛋白浓度。

二、拟穴青蟹抗菌肽Spamprin4-23杀菌动力学曲线

选取施氏假单胞菌作为待测菌，对拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

具体方法如实施例2中所述的抗菌活性测定类似。调整Spamprin

杀菌指数是指经过一定时间共孵后，待测实验组的克隆数与阴性对照组克隆数的比值，用百分比表示(参见图1)。

三、拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

选取尖孢镰孢、黑曲霉、腐皮镰孢作为待测菌，观察拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

具体方法如一中所述的抗菌活性测定类似。调整Spamprin

四、拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

选取施氏假单胞菌、尖孢镰孢作为待测菌株，扫描电镜样品的制备按以下步骤进行：

(1)如实施例2所述制备施氏假单胞菌(OD

(2)用灭菌纯水溶解合成肽Spamprin

(3)悬液和蛋白等体积混合后在适宜温度孵育适宜时间。

(4)加入等体积戊二醛固定液，4℃固定2h后，1000g离心10min。

(5)去尽上清，PBS清洗一次，1000g离心10min。

(6)去除大部分上清，留约10μL液体，将剩余悬液滴在玻片上，4℃静置过夜。

(7)PBS清洗一次。

(8)30％－50％－70％－80％－90％－95％－100％－100％(v/v)乙醇逐级脱水，每级脱水15min。

(9)用叔丁醇置换乙醇，4℃过夜冷冻；或者醋酸异戊酯置换乙醇后待干燥。

(10)叔丁醇脱水的用冷冻干燥仪冷冻干燥；醋酸异戊酯脱水的用临界点干燥仪干燥。

(11)喷金后用扫描电子显微镜观察及拍照。(参见图5和图6)

五、拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

选取正常拟穴青蟹血细胞，对拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

(1)收集生长状态良好的拟穴青蟹血细胞，调整细胞浓度为1×10

(2)小心吸出培养基，加入含有不同浓度(0μM、3μM、6μM、12μM、24μM、48μM、96μM)Spamprin

(3)加入20μL MTS-PMS溶液后避光孵育2h后，使用酶标仪测得OD

本发明的拟穴青蟹抗菌肽Spamprin

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400> 1

Ala His Cys Gln Thr Arg Arg Thr Ala Ser Ser Pro Arg Trp Ser Arg

1 5 10 15

His Arg Gly Ala

20