一种白细胞介素21和4-1BBL诱导外周血单个核细胞中NK细胞增殖的方法

摘要

本发明公开了一种白细胞介素21和4-1BBL诱导外周血单个核细胞中NK细胞增殖的方法。该方法包括如下步骤：将初始NK细胞与固相化的细胞因子共培养，使NK细胞增殖。实验结果表明：利用固定化的细胞因子直接刺激未经筛选的人外周血中的淋巴细胞群，大量扩增了具有杀伤活性的原代NK细胞，并将刺激NK细胞的信号传导转化为人为可控的形式，在临床上为NK细胞治疗提供了安全有效、便利且效果稳定的扩增方案，并为随后的改造NK细胞和研究信号传导机制提供基础研究。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种白细胞介素21和4-1BBL诱导外周血单 个核细胞中NK细胞增殖的方法。

背景技术

自然杀伤细胞(naturalkillercells,NK细胞)是淋巴细胞的一个亚群，占外周血淋 巴细胞总数的10％～15％。常用的人NK细胞的表型标志是CD56⁺、CD16⁺、CD19^‐、CD3^‐， 与T细胞的表型(TCRαβ或TCRδγ或CD3⁺)和B细胞的表型(CD19⁺或BCR)有显著差 异。NK是不同于T、B细胞，具有直接杀伤靶细胞效应的一类淋巴细胞，其对靶细胞 的杀伤作用表现为一种速发效应，无须预先致敏，与靶细胞混合后4小时内即发挥杀 伤效应。NK细胞杀伤效应的机制与细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxiclymphocyte，CTL) 相似，靶细胞包括肿瘤细胞、病毒或细菌感染的细胞及机体某些正常的细胞。NK细胞 具有抗肿瘤、抗感染、免疫调节等功能，并参与移植排斥反应，自身免疫病和超敏反 应发生。

当前有多种增强NK细胞杀伤肿瘤细胞效益的策略，已知部分的细胞因子比如白 介素2，白介素12，白介素15，白介素18，白介素21和I型干扰素(IFN-αandIFN-β) 均通过直接或间接激活的作用活化扩增NK细胞。4-1BB/4-1BBL(CD137/CD137L) 是一种协同刺激分子。在广义上，协同刺激分子通道是一种依赖细胞膜表面糖蛋白交 互作用的细胞间信号传递方式。在结构上4-1BB/4-1BBL属于肿瘤坏死因子 (TNFR/TNF)家族，TNFR/TNF家族有超过27个成员，大多数以三聚体的膜分子或 可溶性分子形式发挥作用。含有受体相关因子(TRAF)结合域的4-1BBL分子的胞质 尾区以受体配体的方式结合到4-1BB上(TRAFs)，随后激活下游信号。有文献报道， 伴随NK细胞FcRγIII(CD16)识别靶细胞后，4-1BB/4-1BBL作为协同刺激分子在功 能上诱导细胞的活化增殖、抗凋亡作用，尤其是促使NK细胞释放IFN-γ等细胞因子 并诱导ADCC作用。此外，目前已知4-1BBL激发的肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细 胞，能产生长久的抗肿瘤效应，也由此被广泛应用到CAR-T细胞治疗中。

免疫磁珠(Immunomagneticbeads,IMB)由载体微球和免疫配基结合而成。载体 微球可由不同的制备材料和方法形成疏水-亲水、非极性-极性和带正电荷-带负电荷等 不同物理性质。球体内核或夹层添加磁性氧化铁后成为磁性微球，磁珠外层通常包裹 以无生物毒性的高分子材料，化学功能由外壳的配基来实现，相关基团常见的有羧基、 氨基、环氧基等。再结合免疫活性的功能基团(如抗体、抗原及亲和素类的扩链剂等)， 利用特异性的免疫学反应结合目的物(如蛋白、细胞、RNA及多种小分子)，在磁力 作用下，发生力学移动，从混合溶液中将特异性结合的物质分离开。具有分离速度快、 效率高，可重复性好，操作简单，无需昂贵仪器设备的特点。

上个世纪70年代中期免疫磁珠被发现以来，人们利用其固相化的优点以及免疫学 反应的特异性，不断广泛地应用于各个领域中，尤其在免疫细胞分离、细胞培养、免 疫吸附、检测细菌和其他微生物方面的应用，甚至创造了相当的产业价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种增殖NK细胞的方法。

本发明提供的增殖NK细胞的方法包括如下步骤：将初始NK细胞与固相化的细 胞因子共培养，使NK细胞增殖。

上述方法中，所述固相化是使所述细胞因子固定连接到固相载体上。

上述方法中，所述初始NK细胞存在于外周血单个核细胞中。

上述方法中，所述使所述细胞因子固定连接到固相载体上的方法为：将细胞因子 生物素化；再用链霉亲和素标记固相载体；将生物素化的细胞因子与链霉亲和素标记 的固相载体偶联，得到所述固相化的细胞因子。

上述方法中，所述固相载体为天然材料或人工合成材料；具体为磁珠。

上述方法中，所述细胞因子为能与4-1BB受体结合的蛋白质分子和与IL-21受体 结合的蛋白质分子。

上述方法中，所述与4-1BBL受体结合的蛋白质分子为人4-1BBL因子。

上述方法中，所述人4-1BBL因子的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述人 4-1BBL因子的编码基因序列如序列表中序列1所示。

上述方法中，所述与IL-21受体结合的蛋白质分子为人IL-21因子。

上述方法中，所述人IL-21因子的氨基酸序列如序列表中序列4所示；所述人IL-21 因子的编码基因序列如序列表中序列2所示。

本发明的另一个目的是提供一种用于增殖NK细胞的产品。

上述所述的产品为固相化的细胞因子。

上述产品中，所述固相化是使所述细胞因子固定连接到固相载体上。

上述产品中，所述使所述细胞因子固定连接到固相载体上的方法为：将细胞因子 生物素化；再用链霉亲和素标记固相载体；将生物素化的细胞因子与链霉亲和素标记 的固相载体偶联，得到所述固相化的细胞因子。

上述产品中，所述固相载体为天然材料或人工合成材料；具体为磁珠。

上述产品中，所述细胞因子为能与4-1BB受体结合的蛋白质分子和与IL-21受体 结合的蛋白质分子。

上述产品中，所述与4-1BBL受体结合的蛋白质分子为人4-1BBL因子。

上述产品中，所述人4-1BBL因子的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述人 4-1BBL因子的编码基因序列如序列表中序列1的第88-642位核苷酸分子所示。

上述产品中，所述与IL-21受体结合的蛋白质分子为人IL-21因子。

上述产品中，所述人IL-21因子的氨基酸序列如序列表中序列4所示；所述人IL-21 因子的编码基因序列如序列表中序列2的第1-393位核苷酸分子所示。

本发明提供了一种白细胞介素21和4-1BBL诱导外周血单个核细胞中NK细胞增 殖的方法。该方法包括如下步骤：将初始NK细胞与固相化的细胞因子共培养，使NK 细胞增殖。实验结果表明：利用固定化的细胞因子直接刺激未经筛选的人外周血中的 淋巴细胞群，大量扩增了具有杀伤活性的原代NK细胞，并将刺激NK细胞的信号传 导转化为人为可控的形式，在临床上为NK细胞治疗提供了安全有效、便利且效果稳 定的扩增方案，并为随后的改造NK细胞和研究信号传导机制提供基础研究。

附图说明

图1为目的基因PCR扩增后的核酸电泳结果。

图2为目的重组子转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后的PCR验证结果。

图3为SDS-PAGE检测目的蛋白GST-h4-1BBL-BirA-tag小量诱导表达的结果。

图4为SDS-PAGE检测目的蛋白hIL-21-BirA-tag小量诱导表达的结果。

图5为SDS-PAGE检测初步纯化的目的蛋白h4-1BBL-BirA-tag。

图6为分子筛纯化目的蛋白h4-1BBL-BirA-tag的洗脱结果。

图7为分子筛纯化目的蛋白hIL-21-BirA-tag的洗脱结果及SDS-PAGE检测纯化结 果。

图8为分子筛纯化生物素化后的目的蛋白h4-1BBL-BirA-tag及SDS-PAGE检测纯 化结果。

图9为分子筛纯化生物素化后的目的蛋白hIL-21-BirA-tag。

图10为SA迁移实验验证目的蛋白的生物素化效率。

图11为流式直接检测磁珠对两种细胞因子的固定化效率。

图12为竞争偶联法反向验证固化细胞因子的饱和反应量。

图13为梯度稀释Biotin-4-1BBL反向验证并估算最佳反应量。

图14为通过FACS用抗CD45-FITC鉴定人PBMC中目的淋巴细胞群。

图15为FACS检测固化或游离4-1BBL/IL-21刺激PBMC前后的NK细胞在目的 淋巴群中所占的比例。

图16为成像系统直观比较不同刺激组体外杀伤K562-Luc毒性实验。

图17为比较4-1BBL/IL-21游离或固化的共刺激形式。

图18为比较游离或固化的单因子刺激条件时的杀伤效应。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

人的外周血单个核细胞(PBMC)是从人的浓缩白细胞中分离得到的；人的浓缩 白细胞可从北京红十字血液中心获得。

生物素化Buffer配方(500ml)：20mMTrisHCl(1.57g)，50mMNaCl(1.46g)， 将pH调至8.0，过滤后使用。

实施例1、人类白细胞介素-21和人类细胞因子4-1BBL的表达与纯化

一、载体的构建

1、载体pGEX-6p-1-h4-1BBL-BirA-tag的构建

(1)目的基因编码序列查询

NCBIReferenceSequence:NM_003811.3

(2)重组目的基因的构成

我们攫取了人类的4-1BBL(即人类CD137ligand)的胞外区184个氨基酸对应的 基因作为目的基因，并在其N端通过一个Linker结构连接了一个生物素化酶的识别位 点BirA-tag，另外在引物设计中，分别在正向引物和反向引物中引入了限制性内切酶 酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ。

(3)目的基因的克隆

分离人的外周血单个核细胞(PBMC)约1×10⁷个，提取RNA，逆转录获得cDNA， 待用。所用的Linker氨基酸序列为(GGGGS)3结构。Linker，BirA-tag和各引物对应 的核苷酸序列如下表1所示。

表1、引物序列(下划线所示的序列代表酶切位点)

P1 5’-CCGCTCGAGTTATTCCGACCTCGGTGAAGGGAGTCCGG-3’ P2 5’-AGCGGCGGCGGGGGCAGTGGAGGAGGGGGATCACGCGAGGGTCCCGAGCTTTCG-3’ P3 5’-AGGCCCAGAAGATCGAGTGGCACGGAGGCGGAGGTAGCGGCGGCGGGGGCAGTGGAGG-3’ P4 5’-CGCGGATCCGGTCTGAACGACATATTTGAGGCCCAGAAGATCGAGTGGCACGG-3’ BirA-tag 5’-GGTCTGAACGACATATTTGAGGCCCAGAAGATCGAGTGGCAC-3’ Linker 5’-GGTGGTGGGGGTTCGGGCGGCGGGGGCTCGGGAGGAGGGGGATCG-3’

overlapPCR分三步进行，引物P1带有一个XhoⅠ酶切位点，并在每一步中作为 公共反向引物。第一步，以上述获得的cDNA为模板，以P1和P2为引物，进行PCR 扩增，将扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，所得的产物为产物1；第二步，以产物1 为模板，以P1和P3为引物，进行PCR扩增，将扩增产物进行核酸电泳，切胶回收， 所得的产物为产物2；第三步，以产物2为模板，以P1和P4(P4带有一个BamHⅠ 酶切位点)为引物，进行PCR扩增，同理将扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，所得 的产物即目的基因片段h4-1BBL-BirA-tag。

通过上述的overlapPCR方法，将Linker序列及BirA酶识别位点BirA-tag序列 依次连接到人类4-1BBL胞外段基因序列的N端，同时得到扩增，所得的序列大小为 660bp，如图1a所示。

(4)目的基因与载体的连接

此处所用载体为pGEX-6p-1(购自上海北诺生物科技有限公司，产品货号addgene 0170)。将扩增的目的基因和质粒pGEX-6p-1均用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进 行酶切，酶切完全后分别进行核酸电泳，切胶回收。将酶切后的目的基因和载体，用 T4DNA连接酶进行连接，得到重组载体pGEX-6p-1-h4-1BBL-BirA-tag。

(5)重组质粒的转化

a、将分装好的大肠杆菌感受态细胞DH5α(50ul/管)，置于冰上融化；

b、将10ul连接产物加入到感受态细胞中，混合均匀，冰上放置30分钟；

c、热击转化：将上感受态细胞悬液管置于42℃水浴中，热击90秒后置于冰上2 分钟；

d、将热击后的感受态细胞悬液涂布在具有氨苄抗性的固体LB培养基上，37℃下 培养过夜(14-18小时)，待长出单菌落。

(6)阳性重组子的筛选

a、挑取2个单菌落，分别接种到5支含有50ug/ml氨苄的3mlLB培养管中，37℃， 200rpm条件下培养；

b、待培养基变浑浊时，分别取出50ul菌液于1.5ml的EP管中，煮沸10分钟；

c、离心12000rpm，5分钟，取上清作为PCR模板；

d、PCR鉴定阳性重组子。PCR条件同前目的基因的扩增。另外设置一组无模板 的PCR对照组。PCR完成后，进行核酸电泳，用紫外分析仪进行分析，若实验组出现 目的条带，且对照组无目的条带出现，则出现目的条带的组为阳性结果，即对应的菌 落为阳性重组子，结果如图2所示。

对阳性重组子进行测序验证，结果表明：在pGEX-6p-1载体的BamHⅠ和XhoⅠ 酶切位点间插入的序列如序列表中序列1所示，4-1BBL基因序列如序列表序列1中第 88-642位核苷酸分子所示，Linker序列如序列表序列1中第43-87位核苷酸分子所示， BirA酶识别位点BirA-tag序列如序列表序列1中第1-42位核苷酸分子所示，表明载 体正确。

(7)重组载体的获取

a、将上一步中筛选出来的阳性单菌落进行划线，37℃过夜培养；

b、挑取单菌落接种到1支5ml含有50ug/ml氨苄的LB培养管中，37℃，200rpm 条件下过夜培养；

c、用质粒小提试剂盒，从过夜培养的菌液中提取质粒；

d、将提取的质粒置于-20℃保存待用。

2、载体pET-28a-hIL-21-BirA-tag的构建

(1)目的基因编码序列查询 THomosapiensinterleukin21,mRNA(cDNAcloneMGC:95404IMAGE:7216979), completecds

(2)重组目的基因的构成

我们选取去除信号肽的人类白介素21的编码序列基因为目的基因，并在其C端， 通过一个Linker结构连接一个BirA-tag。另外在引物设计中，分别在正向引物和反向 引物中引入了限制性内切酶酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ，并且在N端通过载体引入 6×His–tag。

(3)目的基因的克隆

表2、引物序列(下划线所示的序列代表酶切位点)

P5 5’-GAATTCCATATGCAAGATCGCCACATGATTAGAATGC-3’ P6 5’-CGAGCCCCCGCCGCCCGAACCCCCACCACCGGAATCTTCACTTCCGTGTGTTC-3’ P7 5’-GAAGATGTCGTTGAGGCCCGATCCCCCTCCTCCCGAGCCCCCGCCGCCCGAACC-3’ P8 5’-CCGCTCGAGTTAGTGCCATTCGATTTTTTGTGCTTCGAAGATGTCGTTGAGGCC-3’

引物序列如表2所示，P5用作公共正向引物，并带有一个NdeⅠ的酶切位点。PCR 依然分三步进行：第一步，以上述步骤1中获得的cDNA为模板，以P5和P6为引物， 进行PCR扩增，将扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，所得的产物为产物1；第二步， 以产物1为模板，以P5和P7为引物，进行PCR扩增，将扩增产物进行核酸电泳，切 胶回收，所得的产物为产物2；第三步，以产物2为模板，以P5和P8(P8带有一个 XhoⅠ酶切位点)为引物，进行PCR扩增，同理将扩增产物进行核酸电泳，切胶回收， 所得的产物即目的基因片段hIL-21-BirA-tag。

通过overlapPCR方法，将Linker序列、BirA酶识别位点BirA-tag序列依次连接 到人类白细胞介素21基因序列的C端，同时得到扩增，所得的序列大小为504bp，如 图1b所示。

(4)目的基因与载体的连接

此处所用载体为pET-28a(购自上海北诺生物科技有限公司，产品货号addgene 0021)。将扩增的目的基因hIL-21-BirA-tag和质粒pET-28a均用NdeⅠ和XhoⅠ进行 酶切，酶切完全后分别进行核酸电泳，切胶回收。将酶切后的目的基因和载体，用T4 DNA连接酶进行连接。连接条件同pGEX-6p-1与h4-1BBL-BirA-tag的连接。连接完 成后置于4℃保存待用。

(5)重组质粒的转化

同上述所述的步骤。

(6)阳性重组子的筛选

对阳性重组子进行测序验证，结果表明：在pET-28a载体的NdeⅠ和XhoⅠ酶切 位点间插入的序列如序列表中序列2所示，IL-21基因基因序列如序列表序列2中第 1-393位核苷酸分子所示，Linker序列如序列表序列2中第394-438位核苷酸分子所示， BirA酶识别位点BirA-tag序列如序列表序列2中第439-483位核苷酸分子所示，表明 载体正确。

(7)重组质粒的获取

以上(5)、(6)、(7)三步的实验方法均同载体pGEX-6p-1-h4-1BBL-BirA-tag的 构建，但是此时所用的固体和液体培养基抗性均为卡那霉素抗性，工作浓度均为 50ug/ml。

二、蛋白的表达

1、蛋白h4-1BBL-BirA-tag的表达

(1)小量诱导表达筛选阳性单克隆

a、将前面构建好的重组质粒pGEX-6p-1-h4-1BBL-BirA-tag通过热击的方法转入 大肠杆菌感受态BL21中。实验步骤同转化感受态DH5α；

b、随机挑取4个单克隆，接种到5ml含有50ug/ml氨苄的LB培养基中，37℃， 200rpm条件下培养；

c、当菌液OD600约为0.6时，加入0.5mM的IPTG诱导，诱导5小时；

d、制备SDS-PAGE样品：从各管中取诱导前及诱导后的菌液分别100ul，离心， 去上清，加入20ulddwater和5ul5×的蛋白loadingbuffer，将菌体重悬；

e、将样品煮沸10分钟，冷却后待蛋白电泳；

f、制12％的蛋白胶，进行SDS-PAGE实验；

g、用考马斯亮蓝染色剂染色，然后用脱色剂脱色，分析蛋白条带。若与诱导前相 比，诱导后出现明显的目的蛋白条带，则对应的单克隆为阳性。

图3为转化了质粒pGEX-6p-1-h4-1BBL-BirA-tag后的三个随机单克隆，图中所示 的诱导表达的蛋白为GST-h4-1BBL-BirA-tag融合蛋白，其MW约为48KD。结果表明： 与诱导前相比，三个单菌落经诱导后均有目的蛋白的表达，均为阳性单克隆。

(2)蛋白的大量表达及纯化

a、蛋白的大量表达

将筛选的阳性单菌落重新划线，置于37℃过夜培养，待长出单菌落时，随机挑取 一个单菌落，接种到5ml含有50ug/ml氨苄的LB培养基中，37℃，200rpm条件下过夜 培养。从以上5ml的菌液中取3ml接种到300ml含有50ug/ml氨苄的LB培养基中，37℃， 200rpm条件下培养4小时。然后从以上300ml的菌液中取出50ml，接种到1L含有 50ug/ml氨苄的LB培养基中，37℃，200rpm条件下培养；当菌液OD₆₀₀约为0.6时，加 入0.5mM的IPTG诱导，20℃，120rpm，诱导过夜。

b、蛋白的初步纯化

离心收菌，8000rpm，4℃，10分钟，将菌体重悬于30ml的1×PBS中，再加入1mg/ml 的溶菌酶，混合均匀，室温放置30分钟后超声破碎，离心，12000rpm，4℃，20分钟， 保留上清去沉淀，将上清用谷胱甘肽琼脂糖层析柱进行初步纯化，用PSP酶进行柱上 过夜切割，去除GST标签，洗下目的蛋白。图5为洗脱下来的目的蛋白用SDS-PAGE 实验检测的结果图。

c、蛋白的进一步纯化

将柱上回收的蛋白溶液用浓缩管浓缩至1ml，12000rpm，离心1分钟，去沉淀， 处理快速蛋白液相色谱(FPLC)柱子，然后上样，根据蛋白的预计大小收集目的峰。 如图6所示，该蛋白在溶液中呈二聚体状态存在，分子量大小约为46KD，如图中紫 外吸收峰所示位置。

2、蛋白hIL-21-BirA-tag的表达

(1)小量诱导表达筛选阳性单克隆

此实验过程同h4-1BBL的表达，只是转化的质粒为pET-28a-hIL-21-BirA-tag，培 养基的选择抗性为卡那霉素。

图4为转化了质粒pET-28a-hIL-21-BirA-tag后的三个随机单克隆，图中所示的诱 导表达的蛋白为hIL-21-BirA-tag蛋白，其MW约为22KD。结果表明：与诱导前相比， 三个单菌落经诱导后均有目的蛋白的表达，均为阳性单克隆。

(2)蛋白的大量表达及纯化

a、蛋白的大量表达

将筛选的阳性单菌落重新划线，置于37℃过夜培养，待长出单菌落时，随机挑取 一个单菌落，接种到5ml含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm条件下 过夜培养。从以上5ml的菌液中取3ml接种到300ml含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基 中，37℃，200rpm条件下培养4小时后。然后从以上300ml的菌液中取出100ml，接 种到2L含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm条件下培养。当菌液OD₆₀₀约为0.8时，加入1mM的IPTG诱导，37℃，200rpm条件下诱导过夜。

b、包涵体的获取

1)收1-2L上述获得的菌液，置于冰上；

2)分别取12.5ml的Solutionbuffer和13ml的lysisbuffer，置于两个50ml离心管 中，均加入1.5425mg/ml的DTT，另外在lysisbuffer中，加入少量的溶菌酶(from chickeneggwhite)；

3)用加有DTT的Solutionbuffer(12.5ml)将菌溶解(倒入菌体后，冰上放置约 半小时，用枪搅起，振荡器混均匀)；

4)将加入DTT和溶菌酶的lysisbuffer(13ml)倒入菌液中，混均匀，室温放置 1h左右(中间可适当混几次)；

5)超声破碎：200w，工作4S，停8S，2×99次/轮，超至菌液像水一样不再粘稠 即可；

6)离心：4℃，11000g，20min；

7)离完心，上清取样20ul+5ul5×loadingbuffer，以备SDS-PAGE；

8)去上清，若固体表面有粘状菌体，用玻棒小心刮下；

9)用加有DTT的washingbufferwithTritonX-100，溶解(先加10ml)左右，用 枪头搅起，在振荡器上震荡溶解，再加至30ml左右，超声200w，工作4秒，停8秒， 1轮99次(此时，若发现一轮超完后，不见太大改变，可不换buffer，再超一轮)；

10)离心：4℃，11000g/132rpm，20min；

11)同上9，再洗一次；

12)沉淀用加有DTT的washingbufferwithoutTritonX-100，溶解，同上操作(溶 解、超声、离心)；

13)去上清，取些许沉淀，制备“包涵体DSD-PAGE”样品，称重，空管重，带包 涵体重，计算包涵体湿净重，计算所需变性buffer的体积，干净重约为湿净重的1/2～2/3， 一般变性溶解后，按50mg/ml进行计算；

14)计算后用6M胍缓冲液溶解包涵体；

15)将沉淀包涵体用玻棒先尽量倒碎，加入盐酸胍变性溶液，置于4℃，转入搅 拌，待完全溶解；

16)离心(离心机最大转速20000rpm，20min，4℃)；

17)取上清，分装到EP管中，1ml/管，即为蛋白变性溶液，待复性。

c、包涵体复性(快速稀释法复性)

准备refoldingbuffer50ml，加入适量的还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽，以及 PMSF，置于4℃层析柜中预冷。取200-500ul的蛋白变性溶液，与3M的盐酸胍溶液 按1：4混合稀释变性蛋白，然后将稀释后的蛋白溶液慢滴入refoldingbuffer中，滴加 的同时，快速搅拌，待变性蛋白全部滴入后(滴入量的控制，以蛋白饱和析出为标准)， 调慢转子的速度，慢速搅拌过夜复性。复性完成后，用截留量为10KD的浓缩管浓缩 所有的复性液。

d、Ni柱初步纯化复性的目的蛋白

图7为纯化的蛋白峰图，目的蛋白分子量约为22KD，在嵌入的SDS-PAGE实验 结果图中，1为蛋白Marker；2、3、4和5分别是从第一个蛋白峰依次收集的4管蛋 白，每管0.5ml，该图证明先洗脱下来的蛋白峰为目的蛋白峰。

实施例2、人类白细胞介素21和4-1BBL的生物素化及鉴定

1、蛋白的生物素化反应

(1)反应前准备：将实施例1中制备好的蛋白用脱盐柱换Buffer，换成适宜反应 的生物素化Buffer。

(2)反应体系：1-2mg的目的蛋白浓缩到700ul；分别加入100ul的BufferA、BufferB 和d-biotin；分别加入2ul胃蛋白酶抑制剂和亮抑蛋白酶肽；另外加入蛋白-生物素连接 酶50ul。

(3)反应条件：将上反应体系混合均匀，置于金属恒温仪中，控温25度，过夜连 接。

2、生物素化后的目的蛋白的纯化

(1)h4-1BBL-biotin的纯化

将1ml的反应后的混合蛋白溶液，直接通过FPLC分子筛进行纯化，收集目的蛋 白峰，用SDS-PAGE进一步验证收集的蛋白是否为目的蛋白。图8为h4-1BBL-BirA-tag 蛋白生物素化后重新用分子筛纯化的图，其中1：peak1；2：peak2；3：未生物素化 的h4-1BBL-BirA-tag蛋白；4：未纯化的生物素化的h4-1BBL-BirA-tag蛋白；5：Marker。

(2)hIL-21-biotin的纯化

先将生物素化反应体系的混合蛋白溶液，用镍柱进行初步纯化，洗脱下目的蛋白， 浓缩成1ml后再用FPLC分子筛进行纯化。图9为经过镍柱纯化后的hIL-21-biotin进 一步通过分子筛纯化的结果图，从图中可以看出，此时的目的蛋白hIL-21-biotin已经 达到100％的纯化效果。

3、SA迁移实验验证目的蛋白的生物素化效率

迁移实验原理为：目的蛋白经过生物素化后，每个蛋白分子理论上都结合上了一 个生物素分子，那么在与适量的SA反应后，通过生物素和SA的结合(理论上一个 SA分子可以结合4个生物素分子)，可以将目的蛋白迁移到泳道上方，结果与只有目 的蛋白的泳道相比，目的蛋白消失，与只有SA的泳道相比，会出现新的条带，这些 条带就是不同形式的SA(单体或多聚体)与目的蛋白结合后出现的新蛋白形式。

(1)迁移实验样品准备：样品1：目的蛋白；样品2：目的蛋白+SA；样品3：SA。 样品1和样品2中的目的蛋白等量；样品2和样品3中的SA等量。以上3种样品， 以样品2的体积为固定标准，将样品1和样品3分别用1×PBS补加到标准体积，且控 制好最终的总体积，使每个样品都可以全部上样在对应的同一泳道内。

(2)连接反应：将以上3个样品调整到一致的体积后，混合均匀，同时置于冰上 反应0.5～1个小时。

(3)SDS-PAGE实验验证迁移效果：向以上反应结束的3个样品中加入适量的蛋 白胶loadingBuffer，上样12％的蛋白胶，进行电泳。电泳结束后用考马斯亮蓝染色液 染色，然后脱色。观察SA迁移效果。

图10为SA迁移实验验证目的蛋白的生物素化效率，其中a和b分别为蛋白 h4-1BBL-BirA-tag和hIL-21-BirA-tag的生物素化效率的检测，1：Marker；2：生物素 化的目的蛋白；3：生物素化的目的蛋白和SA；4：SA。从实验结果图中可以看出， 我们所制备的两种目的蛋白h4-1BBL-BirA-tag和hIL-21-biotin-BirA-tag都达到了90％ 以上的生物素化效率，可以应用于下一步实验。

实施例3、固定化的白细胞介素21和4-1BBL对人外周血单个核细胞中NK细胞 的扩增和毒性诱导实验

一、刺激因子的固定化反应及固定化检测

1、洗涤：取适量充分重悬后的链霉亲和素磁珠(购自美国life公司，11206D)到 1.5mL离心管中，用至少1000μL的PBST洗涤液加至离心管中混匀磁珠(涡旋5秒 或在旋转混合仪上斜置旋转5分钟以上)。在磁分离架上静置至少2分钟，充分分离后 用移液器吸出上清，重复洗涤两次。最终磁分离后用500μLPBS重悬，置于4℃待用。

2、偶联：根据上述计算，取等摩尔量的biotin-4-1BBL和biotin-IL21混合于500μL 的PBS溶液中，再加入相应量的磁珠中，用PBS定容至1mL，涡旋5秒混匀(注： 总体积应为离心管体积的1/3到2/3之间)，用封口膜封闭离心管后置于旋转混合仪上， 于4℃恒温箱中反应至少6小时。反应结束后用磁分离架移去上清，用PBST润洗磁 珠2次，磁分离后用200μL的含5％人血清的培养基于4℃过夜封闭磁珠。

3、磁珠准备：取等量偶联后磁珠4-1BBL-IL21-Beads，1～5×10⁶个/组，分别作IL-21 检测、4-1BBL检测、双因子检测组，取每管等量磁珠作为阴性对照组。将磁珠分别置 于1.5mL离心管中，用至少1mL的PBST溶液洗涤磁珠，磁分离后移去溶液，用1mL PBS重悬磁珠，置于冰上待用。

4、检测IL-21：IL-21检测组(A)加入1Test的鼠抗His标签IgG，置于旋转混 合仪上，于4℃恒温箱中反应1小时，反应结束后磁分离移去溶液，并用PBS洗一遍 后，用1mLPBS重悬；IL-21检测组(A)中加入1Test抗鼠IgG-PE，对照组(F)加 入等体积的PBS，用锡箔纸包裹离心管后置于旋转混合仪上，于4℃恒温箱中避光反 应1小时，反应结束后磁分离移去溶液，并用PBS洗一遍后，用PBS重悬后置于避光 环境，待流式细胞术检测(直接鉴定IL-21)。

5、检测4-1BBL：4-1BBL检测组(B)加入1Test的鼠抗His标签IgG，置于旋 转混合仪上，于4℃恒温箱中反应1小时，反应结束后磁分离移去溶液，并用PBS洗 一遍后，用1mLPBS重悬；4-1BBL检测组(B)加入1Test的4-1BB(带HIS标签)， 无4-1BB对照组(D)中加入等量的PBS作为对照，旋转混合仪上，于4℃恒温箱1 小时，反应结束后磁分离移去溶液，并用PBS洗一遍后，用1mLPBS重悬；4-1BBL 检测组(B)和无4-1BB对照组(D)均加入1Test的兔抗His标签IgG，无兔IgG对 照组(E)中加入等量PBS作为对照，反应条件同上，经过PBS洗涤后加入1Test抗 兔IgG-FITC，待流式细胞术检测。

此时4-1BBL-检测组(B)取出部分磁珠可留作双因子检测组(C)，再加1Test 抗鼠IgG-PE，反应条件同上，待流式细胞检测。

结果如图11所示，横坐标为关于IL-21的PE染料染色，纵坐标为关于4-1BBL 的FITC染料染色，其中(A)、(B)、(C)为检测组，(D)、(E)、(F)为重要阴性对 照。

检测组中，(A)为检测组关于IL-21的单染，可知固定了IL-21的磁珠占所有磁 珠的比例高达97.8％；(B)为检测组关于4-1BBL单染，同样4-1BBL阳性的磁珠占所 有磁珠的比例为96.4％，由于4-1BBL的检测是基于封闭IL-21上已有的His标签，一 定程度上会弱化随后偶联的效率，因此显示的阳性结果较弱于组(A)，但仍然具有判 断为阳性结果的特征；(C)为检测组关于IL-21与4-1BBL双染，其结果辅助验证了 已同时装载两个细胞因子的磁珠占总体数量的大多数(80％)。

对照组中，(D)为无添加4-1BB(His)，其阴性结果(96.7％为4-1BBL阴性)排 除了兔抗His标签IgG的非特异性，尤为重要的是，也证明了鼠抗His标签IgG在前 一步偶联中已充分封闭了IL-21上的His，并不影响4-1BB上His标签的免疫识别，换 句话说，如果兔抗His标签IgG能够识别IL-21上的His标签，(D)的结果应为4-1BBL 假阳性。(E)为无添加兔IgG，其结果(91.2％)排除了抗兔IgG-FITC的非特异性吸 附；(F)为4-1BBL-IL-21-Beads直接偶联抗鼠IgG-PE与抗兔IgG-FITC，其阴性结果 (94.6％)排除了二抗的非特异性。

以上结果表明本方法构建的4-1BBL-IL21-Beads，在正向检测体系中，绝大多数 已满足装载双信号的人工抗原递呈细胞的要求。

二、流式检测剩余链霉亲和素位点及细胞因子最佳作用浓度的确定

为了更好地评价磁珠上的固化细胞因子的饱和量，并且进一步探索细胞因子的最 佳反应量，我们还需要负向验证，即通过生物素化的异源蛋白竞争偶联法来检测剩余 链霉亲和素位点。

1、将两种细胞因子分别过量地偶联到磁珠上，反应结束后洗去上清，添加同样过 量的生物素化异源蛋白，使之与磁珠上可能存在的剩余的SA位点反应，最终偶联异 源蛋白的二抗后用流式进行验证。并设立阴性对照组(4-1BBL/IL-21-beads+ Anti-mouseIgG-PE)和阳性对照组(SAbeads+biotin-mouseIgG+Anti-mouseIgG-PE)。

结果如图12所示，(A)和(B)均呈现阴性结果，即表明固定化细胞因子的反应 量充分过量时，不存在能有效结合其余鼠源蛋白的链霉亲和素位点，磁珠接近饱和状 态。

2、我们依照合适的biotin-4-1BBL的浓度梯度稀释细胞因子的浓度，在上述相同 反应条件下分别和等量SA磁珠反应，磁珠的量均为10μg，反应体系均为100μL，同 时设定如上一致的阴性和阳性对照组。

结果如图13所示，(B)、(C)、(D)、(E)、(F)的biotin-4-1BBL添加量依此为5μg、 1μg、0.5μg、0.1μg、0.05μg，随着其添加量的减小，峰位逐渐向阳性方位偏移，即剩 余位点结合异源生物素化蛋白逐渐增多，符合竞争偶联的趋势。由图13可知(D)相 比于阴性对照组有阳性的轻微趋势，但又接近于阴性，因此判断为在此反应浓度下链 霉亲和素位点刚好处于饱和状态，即细胞因子的反应量为最佳反应量。100μg/mL的磁 珠浓度下biotin-4-1BBL的最佳反应量为1～5μg/mL。

三、人原代自然杀伤细胞的活化扩增实验

1、人原代淋巴细胞的分离、冻存和复苏

(1)从北京红十字血液中心取回健康人的浓缩白细胞；

(2)用2-3倍体积的无菌1×PBS稀释40-50mL浓缩白细胞血液；

(3)将人淋巴细胞分离液按5mL/管分装在15mL离心管中，向人淋巴细胞分离液 上层轻轻加入10mL稀释后的浓缩白细胞液体；

(4)25℃条件下800×g离心30min(注：离心时，升速和降速都要慢)；

(5)离心完毕，弃掉上层血清，吸取中间白细胞层，并重悬于4倍体积的无菌 1×PBS；

(6)25℃条件下1000×g离心20min，弃去上清后留沉淀细胞；

(7)用无菌1×PBS重复洗涤两次，即得到人外周血单个核细胞；

(8)短期内不使用的细胞，以10％DMSO和90％胎牛血清作为冻存液重悬细胞， 1ml/支，置于程序降温盒进行梯度降温，待细胞悬液完全凝固后转存于液氮中；

(9)复苏时将冻存管从液氮中迅速移至37℃水浴锅中，晃动3-5分钟，快速溶解 后，室温1500rpm离心5分钟，去上清，用培养液重悬后，移至孔板中并于37℃，5％ CO₂饱和湿度培养箱中培养。

2、淋巴细胞群的确定及刺激前NK细胞数的检测

白细胞共同抗原CD45分子广泛存在于淋巴细胞表面，不存在于红细胞和浆细胞。 因此，在密度梯度离心法分离PBMC后用抗CD45的荧光抗体可用于检测所得的淋巴 细胞纯度。分离后CD45单染的流式结果如图14所示，由图可知FSC和SSC通道将 细胞亚群按照不同大小和密度分为4群，其中编号为Subset1的细胞大多数为CD45 阴性，此群以细胞碎片、红细胞为主；其余位置的子群均以CD45阳性为主。显然淋 巴细胞群主要分布于Subset2的位置，且90％细胞为CD45⁺，因此，我们选择定量收 集此位置的细胞信号(至少1万个)，以准备更细化的亚群分析。

确定淋巴细胞群以后，在刺激前需要检测淋巴细胞群中NK细胞比例(CD3^-和 CD56⁺)，流式结果如图15(Day0)所示，NK细胞在刺激前占淋巴细胞的13.3％。

3、PBMC与4-1BBL-IL21-Beads的共培养

将分离得到的人外周血单核细胞(PBMC)用LDS/PI混合液染色后进行流式计数， 以1×10⁶个活体单核细胞/mL浓度接种于24孔细胞培养板中，并加入3倍数量的 4-1BBL-IL21-Beads，磁珠与细胞数量的比例控制在1:1到5:1之间，此时记为第0天。 细胞培养基为含5％～10％人AB血清的X-Vivo15培养基(Lanza,MD,USA)，添加羟 乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES(终浓度10mmol/L)、丙酮酸钠SodiumPyruvate(终浓度1 mmol/L)、左旋谷氨酰胺L-Glutamine(终浓度2mmol/L)、1％的非必需氨基酸培养基 MEMNEAA和细胞因子IL-2(终浓度100IU/mL)，于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中 培养。

在刺激48h后(第2天)，补充细胞因子IL-2，添加量为100IU/mL，之后每两天 重复补充，以保证细胞液100IU/mL的新鲜IL-2浓度；第3天培养基加至2mL；第6 天培养基加至4mL；第9天培养基加至8mL；第10天，混匀细胞液后取20μL体积加 入到LDS/PI染色液中进行染色，用流式细胞仪计数，每孔补加相同活体单核细胞数量 的4-1BBL-IL21-Beads，以进行第二次刺激；第12天培养基加至12mL；第15天培养 基加至16mL；第18天，培养基加至32mL；第20～21天收获细胞，同时按上述方式 进行活体单核细胞计数。

对照组为分别单独偶联4-1BBL和IL-21的磁珠，对应游离的IL-21(即为sIL-21) 和游离的4-1BBL(即为s4-1BBL)，上述刺激条件以组合添加或单独添加的形式作为 对照，以验证4-1BBL与IL-21在NK细胞表面传递信号的最优方案。将仅添加IL-2刺激 的细胞作为空白对照组，并且根据各组细胞生长的实际情况来调整相应的传代比例， 以保证活细胞浓度在0.5～2×10⁶个/mL之间。

4、刺激后NK细胞的亚群分析

在第20天时，收集共培养扩增前后的淋巴细胞，将细胞浓度用PBS溶液调整为 1×10⁶个/mL，取100μL细胞悬液加入1Test量的FITC标记的鼠抗人CD3抗体和APC标 记的鼠抗人CD56抗体进行染色，置于4℃避光反应30min，用PBS洗2次后在FACS Calibur流式细胞仪上机分析。

在刺激20天后，用流式分析PBMC表型，利用CD3和CD56的抗体区分NK细 胞、NKT细胞和T细胞。由图15可知，本次实验中NK细胞经过20天后的传代培养， 双固定刺激组(4-1BBL-IL21-Beads)可以使NK细胞数量放大130倍，纯度由原先的 13.3％达到90.8％，细胞纯度和数量上都显然优于其他条件。

表3为扩增过程中不同刺激组的扩增倍数及不同亚群的数量明细统计。每个亚群 扩增倍数计算公式为：各亚群扩增倍数＝总的PBMC扩增倍数×(刺激后该亚群的纯度 /刺激前该亚群的纯度)。根据图15，在刺激前的PBMC中，NK细胞(CD3^-和CD56⁺) 的纯度为13.3％，NKT细胞(CD3⁺和CD56⁺)的纯度为0.88％，T细胞(CD3⁺和CD56^-) 的纯度为63.5％。

结果表明：重复刺激组相比单次刺激组在扩增数量上有明显差别，表明了该方法 可重复刺激NK细胞增加扩增效率；另外，游离配合固定化或双游离的IL-21/4-1BBL 刺激组尽管也可以使NK细胞扩增，但扩增倍数并不理想(注：游离形式的细胞因子 的添加量均以固定化的反应量为准)。

表3、固化或游离的4-1BBL/IL-21刺激PBMC后各亚群的扩增情况

实施例4、扩增后的细胞体外杀伤活性实验

靶细胞K562-Luc在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，常规培养于37℃、5％ CO₂的细胞培养箱。培养至对数生长期后，取细胞，用PBS洗3次，计数并调整细胞 密度为1×10⁶/mL(注：整个过程中细胞需置于冰上，最大限度降低其代谢，保持细胞 活性)。在96孔板中每个孔接种1×10⁶个。调整效应细胞数量，按效/靶比0.5:1、1:1、 2:1、4:1和8:1的比例混合细胞，同时设置靶细胞的阴性对照孔。每个孔设置1-2个复 孔。置于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中培养，在12h后每孔取出100μL上清液， 加入100μL荧光素(luciferin)的培养液溶液作为底物，荧光素的终浓度为150μg/mL。 混匀后于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中继续培养10min，使具有活性的K562-luc 分泌的荧光素酶与荧光素充分反应。随后在IVISLuminaIII三维活体成像系统中检测光 子数。选取测量后靶细胞发光光子数量平均值接近的孔作为杀伤结果，用生物数理统 计数据分析作图软件GraphPadPrismv5对数据进一步分析。靶细胞裂解率(％)＝1- (检测孔光子数值/阴性对照孔光子数值)。

已知人骨髓瘤K562细胞高表达NKG2D配体，不表达HLA-I类分子，NK细胞的 非MHC-I类分子限制性可诱导多种杀伤机制杀伤K562细胞，我们利用这一特性，将 各组刺激后的PBMC设置效靶比0.5:1，1:1，2:1，4:1和8:1进行杀伤实验。图16为 IVISLuminaIII三维活体成像系统用于细胞的检测，结果直观显示了不同刺激组体外 杀伤K562-Luc的杀伤效应。

利用K562-Luc活细胞的显色机制用成像系统收集光子信号，最终用软件GraphPad Prismv5制作折线图(图17和图18)作进一步分析。结果显示4-1BBL-IL-21-Beads 刺激组的杀伤效应优于其它任何组，对照组为培养20天仅添加IL-2的PBMC细胞， 仍含有10％左右NK细胞，仅具有有限的杀伤能力，与刺激组有显著差异(P<0.01)， 如图17所示。

总之，固相化的4-1BBL组在信号传递和介导NK细胞的效果来看，优于游离的 4-1BBL；而固相化的IL-21需要在协同刺激分子共刺激条件下，优于游离的IL-21(如 图18)。游离的刺激信号离散地刺激细胞表面受体，而固定化的细胞因子可以相对密 集地与受体结合，在数量和效率上均存在优势。