结核分枝杆菌药敏试验方法及指示剂的应用及固体培养基

摘要

本发明公开了一种结核分枝杆菌药敏试验方法，及用于所述结核分枝杆菌药敏试验方法的指示剂的应用和固体培养基，及用于所述结核分枝杆菌药敏试验方法的加热恒温机和培养盒，其药敏试验方法的步骤为：对提供的标本进行前处理后，加入液体增菌培养基并进行增菌培养，将固体培养基加温熔化，制成液态的固体培养基，将增菌培养后的标本与液态的固体培养基混合，然后冷却凝固，制成带有药敏纸片的固态药敏试验标本，将其培养5-15天，通过指示剂的指示观察药物抑菌圈，确定对药物的敏感性，本发明检验过程时间短，平均检出时间10天左右且投资少、使用成本低、使用安全方便。

说明书

技术领域

本发明涉及对结核分枝杆菌的耐药性进行试验的医学检验领域，具体为一种结核分枝杆菌药敏试验方法，及用于所述结核分枝杆菌药敏试验方法的指示剂的应用和固体培养基，及用于所述结核分枝杆菌药敏试验方法的加热恒温机和培养盒。

背景技术

结核病的耐药性是一个日益严重的公共卫生问题，严重威胁着结核病的控制。中国工程院院士钟南山在两会期间曾称，中国共有450万活动性结核病人，带菌者高达5.5亿，而带菌者一生中有10％的可能性会发病。2009年4月，中国卫生部部长陈竺在北京举行的“耐多药/广泛耐药结核病高负担国家”部长级会议上通报了中国耐药结核病的情况：中国疾病防控中心的抽样调查显示，中国结核病人中，耐多药发病率为8.32％，总计约为12万人，居世界第二位，广泛耐药发病率则为0.68％，总计大约1万人，其危害远远超过艾滋病。药敏试验是对结核分枝杆菌的耐药性进行检测的重要试验。现有的结核分枝杆菌药敏试验方法，一般有纸片检验法和浓度检验法。纸片检验法是通过观察由于贴在固体培养基表面上药物纸片形成的药物抑菌圈来确定结核分枝杆菌对药物的敏感性；浓度检验法是通过观察检测不同药物和不同药物浓度试验容器中结核分枝杆菌的生长情况来确定结核分枝杆菌对药物的敏感性。不管是纸片检验法还是浓度检验法，其整个药敏试验过程一般可分为标本前处理、增殖或分离培养和药敏检验三个阶段。现有的纸片检验法，标本前处理阶段的步骤为：①用吸管吸取提供的标本置于试验容器中；②向试验容器中加入消化液，对标本粘液进行消化，使标本中粘液和杂质包裹的细菌充分暴露；③离心分离，倒掉上清液，获得浓集的标本；在获得浓集的标本后再进行增殖或分离培养。增殖或分离培养阶段的步骤为：④取已经浓集标本的少部分制成浓菌液；⑤将浓菌液接种于固体培养基例如罗氏培养基上进行增殖或分离培养，一般需在37℃培养箱中培养1月左右，把单个细菌培养成细菌菌落；在获得细菌菌落后再进入药敏检验阶段。药敏检验阶段的步骤为：⑥取少量的细菌菌落，一般是取1——3个细菌菌落，将其溶解分散制成浓菌液；⑦将浓菌液接种于固体培养基例如琼脂培养基表面上；⑧在固体培养基表面上贴上药物纸片；⑨放入37℃培养箱中培养1个月左右，观察药物抑菌圈，确定结核分枝杆菌对药物的敏感性。现有的纸片检验法的优点是操作方便、设备简单、投资小；但其存在以下缺点：(1)整个检验所需的时间太长：增殖或分离培养阶段需要1个月左右，药敏检验阶段大约需要1个月左右，整个试验过程大约需要2个月左右。如果在药敏试验得到结果后再使用药物治疗，就会严重影响治疗时机。而临床上在没有药敏试验的情况下使用药物治疗一是可能会造结核分枝杆菌耐药的严重后果；二是对感染耐药性结核分枝杆菌的结核病患者很难达到好的治疗效果。(2)不安全。整个试验需要两次人工接种，由于结核分枝杆菌具有传染性，这样对操作人员形成安全隐患，对环境也形成污染隐患。

现有的浓度检验法，其在增殖培养阶段采用固体培养基，其标本前处理、增殖或分离培养二个阶段的步骤与现有的纸片检验法相同，但药敏检验阶段的步骤与现有的纸片检验法不同，具体为：从固体培养基上取增殖或分离培养获得的细菌菌落，一般是取1个或数个细菌菌落，→→将其溶解分散制成菌悬液→→将菌悬液倒入按不同的药物和不同的浓度配制成的多个试验容器中，制成对比试验标本→→观察检测试验容器中细菌生长情况，确定结核分枝杆菌对药物的敏感性。这种检验方法的优点是设备简单、投资小；但其存在以下缺点：(1)所需的时间长。增殖或分离培养阶段的方法和步骤与现有的纸片检验法的方法和步骤相同，因此，仅增殖或分离培养阶段所需的时间就需要1个月左右；(2)操作麻烦、不安全且容易造成错误的检验结果。由于需要配制多个试验容器，配制过程很麻烦且不安全，对操作人员形成安全隐患，对环境也形成污染隐患；在配制多个试验容器过程中比较容易被其他细菌污染，这样就可能造成错误的检验结果。

此外，还有利用仪器鉴定药物敏感性的方法，例如BACTEC-TB460系统及BACTEC 960系统，其优点是操作简单，试验过程时间短，平均检出时间为14.4天，最快10天左右。但其存在的主要缺点是仪器设备的价位高，投资大；使用成本高，一是仪器设备的使用成本高，二是需要多个对比试验标本，试剂的成本较高，其费用较大，一般医院难以承受，难以推广普及。

从上面详细分析现有的结核分枝杆菌药敏试验方法可以看出，现有的纸片检验法和浓度检验法存在以下缺点：(1)整个检验过程所需的时间长。(2)操作麻烦。(3)不安全。(4)容易出现误检。而利用仪器鉴定药物敏感性的方法投资大，使用成本高，难以推广普及。

发明内容

本发明的目的是提供一种检验过程时间短的结核分枝杆菌药敏试验方法及指示剂的应用及固体培养基；另一个目的是投资少、使用成本低；再一个目的是使用安全方便。

为实现上述目的，本发明结核分支枝杆菌药敏试验方法，包括：

(1)对提供的标本进行前处理，制成浓集标本；

(2)向浓集标本中加入液体增菌培养基I，制成液态增菌培养标本II，增菌培养0～7天；

(3)将固体培养基III加温熔化，制成液态的固体培养基III，然后将其温度降至与上述液态增菌培养标本II相应的培养温度或室温；

所述固体培养基具有50℃～95℃的熔化温度，25℃～45℃的凝固温度；

所述的固体培养基包括有琼脂或琼脂糖，以及营养物质；

(4)将液态增菌培养标本II与液态的固体培养基III混合，制成液态药敏试验标本IV；

(5)将液态药敏试验标本IV凝固，制成带药敏纸片的固态药敏试验标本V；

(6)将固态药敏试验标本V培养5～15天；

(7)通过指示剂的指示观察药物抑菌圈，确定结核分枝杆菌对药物的敏感性。

所述的结核分枝杆菌药敏试验方法，其所述的指示剂为结核分枝杆菌生长或生化反应指示剂。

所述的结核分枝杆菌药敏试验方法，其指示剂包括亚碲酸盐，或亚碲酸盐和尿素，或尿素，或MTT，或XTT，或Alamar-Blue。

所述的结核分枝杆菌药敏试验方法，其所述指示剂亚碲酸盐是在固态药敏试验标本V培养5-15天后，再向固态药敏试验标本V中滴入。

所述的结核分枝杆菌药敏试验方法，除亚碲酸盐外的指示剂成分是在液体增菌培养基I或固体培养基III中加入。

所述(3)步中，制成液态的固体培养基III，然后将其温度降至与上述液态增菌培养标本II相应的培养温度或室温是指在液态增菌培养标本II进行增菌培养的情况下，将液态的固体培养基III的温度降至与液态增菌培养标本II增菌培养时相同或相近的温度即可，若没有进行增菌培养，则降至室温，但固体培养基III仍是以液态的状态存在。

所述的结核分枝杆菌药敏试验方法的指示剂的应用，其所述的指示剂为亚碲酸盐，或为亚碲酸盐和尿素；其中亚碲酸盐是在固态药敏标本V培养5-15天后，再向固态药敏标本V中滴入；尿素是在液体增菌培养基I或固体培养基III中加入。

所述的亚碲酸盐包括亚碲酸钠或亚碲酸钾。

在液态药敏试验标本IV中含有固体培养基III与液体增菌培养基I配比的比例为：每100ml液体增菌培养基I加一份固体培养基III。每一份固体培养基含卵黄液50ml～100ml，可溶性淀粉2g～8g，L-酪蛋白0.1g～0.8g，酚红2ml～8ml，琼脂或琼脂糖0.5g～3.5g，抑菌剂适量。

所述的固体培养基III，还可加入尿素，尿素的加入量为：每一份固体培养基加尿素0.1g～0.5g。

所述的固体培养基III按一次使用的数量密封分装。

所述结核分枝杆菌药敏试验方法的加热恒温机，包括有导热块，电加热装置和温度控制装置，所述导热块设有高温区和恒温区，在高温区设有高温杯卡孔，在恒温区设有恒温杯卡孔。

所述的加热恒温机，在恒温区设有恒温平衡区和混合区，在恒温平衡区设有恒温杯卡孔，在混合区设有混合杯卡孔。

所述的加热恒温机，在混合区还设有倒板卡槽。

所述结核分枝杆菌药敏试验方法的培养盒，包括有周壁和底部封闭、上端敞开的盒体，在盒体的底部设有标尺，在盒体底部的上侧面上贴有药敏纸片。

所述的培养盒，在盒体底部的上侧面上贴有六片药敏纸片。

本发明与现有的纸片检验法和浓度检验法相比，整个试验过程时间短的原因是：①提供的标本中的待检结核分枝杆菌得到了充分利用。由于提供的标本中的结核分枝杆菌被浓集后绝大部分被用于做药敏试验，因此，提供的标本中的待检结核分枝杆菌得到了充分的利用，使药敏试验的初始菌量大，减少增菌培养时间，从而节约整个试验时间。②增殖培养阶段的时间短。由于本发明的增殖培养是在液态增菌培养基中进行，相对而言，细菌在液态增菌培养基中的增殖速度比在固体培养基上的增殖速度快；再加上充分利用了提供标本中的待检结核分枝杆菌，使增殖培养前的初始数量大，因此，增殖培养阶段的时间短，最多只需7天。如果结核病人的病情检测结果是++++，由于其提供用于药敏试验标本中的结核分枝杆菌的数量很大，在做药敏试验时可以省掉增殖培养。③药敏检验阶段时间短。由于本发明是将增殖培养后的液态增菌培养标本II与液态的固体培养基III混合，采用倾注法制成带药敏纸片的固态药敏试验标本V，这样，增殖培养后的结核分枝杆菌全部都用于药敏检验，使得药敏检验的起始菌量大，比较容易形成药物抑菌圈，加上指示剂的指示作用，使抑菌圈能被目测到，药敏检验阶段只需5到15天，比现有的纸片检验法相比所需的时间短。④使用了快速显色指示剂。由于本发明利用亚碲酸盐作指示剂，经发明人反复试验证明，亚碲酸盐能使固态药敏试验标本中形成的菌落在2-48小时内呈黑色或深灰色。⑤使用了前指示剂。由于本发明在固体培养基中加入尿素，结核分枝杆菌会产生尿素酶分解尿素，使固态药检试验标本呈粉红色或淡黄色，在药敏试验阶段，通过观察固态药敏试验标本的颜色，初步判断固态药敏试验标本中结核分枝杆菌生长情况，在固态药敏试验标本呈粉红色或淡黄色后，说明固态药敏试验标本中的结核分枝杆菌数量达到了形成抑菌圈需要的数量，滴入亚碲酸盐指示剂，在2到48小时内即能形成明显的抑菌圈，这样就可以缩短药敏检验阶段时间。经发明人反复试验证明，利用本发明结核分枝杆菌药敏试验方法进行结核杆菌药敏试验，平均检出时间10天左右。综上所述，与现有的纸片检验法和浓度检验法相比，本发明实现了试验过程时间短的目的。

本发明投资少、使用成本低的原因是：实施本发明所需的设备只需配套离心装置、培养箱、加热恒温机等。上述离心装置、培养箱、加热恒温机等制造简单、生产成本低，因此，完成整个试验所需要的设备投资少；实施本发明需要配套使用一次性试验容器以及包括营培养基、指示剂等试剂，这些一次性试验容器和试剂的成本低且使用的数量少，加上本发明仪器设备的投资少使用成本低，进一步减少了本发明的使用成本。因此，与利用仪器鉴定药物敏感性的方法相比，本发明有效地实现了投资少、使用成本低的目的。

本发明使用安全方便的原因是：本发明浓集待检标本、结果判读均可以在一次性密闭容器内进行，不会污染其他器材，操作完成后进行统一消毒处理，并且整个检验过程手工操作的程序很少且简单，这样就减少了结核分枝杆菌对工作人员和环境的影响，大大地提高了试验的生物安全性；减少了被其他细菌污染的机会，能有效地减少错误检验结果的出现。因此，与现有的纸片检验法和浓度检验法相比，本发明能有效地实现使用安全方便的目的。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明结核分枝杆菌药敏试验方法及指示剂的应用及固体培养基作进一步说明

图1所示为本发明中的加热恒温机俯视图示意图。

图2为图1所示加热恒温机的A-A剖视图示意图。

图3所示为本发明中的培养盒去掉盒盖后的俯视图示意图。

图4为图3所示培养盒的剖视图示意图。

1、机壳，2、倒板卡槽，3、混合杯卡孔，4、导热块，5、隔热墙，6、高温杯卡孔，7、控制面板，8、恒温杯卡孔，9、电加热装置，10、盒体，11、药敏纸片，12、标尺，13、盒盖。

具体实施方式

图1、图2所示为加热恒温机，在机壳1上安装有导热块4，导热块4分为高温区和恒温区，高温区的温度为在50℃-95℃范围内可调，其中最佳温度为90℃；恒温区的温度为在25℃-45℃范围内可调，其中最佳温度为42℃；在高温区中设有高温杯卡孔6和控制面板7，在恒温区中设有恒温平衡区和混合区，在恒温平衡区中设有恒温杯卡孔8，在混合区中设有混合杯卡孔3和倒板卡槽2，在高温区和恒温区之间设有隔热墙5，在导热块4中设有电加热装置9，在机壳1中设有温度控制装置。

图3、图4所示为培养盒，盒体10为周壁和底部封闭、上端敞开的结构形式，在盒体10的底部设有标尺12，在盒体10底部的上侧面上贴有药敏纸片11，在盒体10的敞开端配套有盒盖13。

下面给出本发明结核分枝杆菌药敏试验方法及指示剂的应用及固体培养基的实施例：

本实施例的培养盒，在盒体10底部的上侧面上贴有六片药敏纸片11，盒体10的容积为30ml。

1、将患者晨痰标本留取5ml用2％氢氧化钠和0.5％NALC混合液消化；

2、置于离心机中，以4500转/分钟的转速离心分离10分钟，将标本中结核分枝杆菌充分沉淀；

3、去掉上清液，制成浓集标本，完成标本的前处理；

4、用10ml液体增菌培养基I将浓集标本洗脱制成液体菌悬液形式的液态增菌培养标本II；

5、将液态增菌培养标本放入37℃的培养箱中增菌培养，具体增菌培养的时间视患者排菌量定，如果结核病人的病情检测结果是++++，则可以不增菌培养；

6、制作液态结核分枝杆菌药检试验标本：

(1)将加热恒温机中的高温区温度设定为90℃，恒温区温度设定为42℃；

(2)将固体培养基III放入加热恒温机高温区中的高温杯卡孔6中加热熔化至液态；液态增菌培养标本II与液态的固体培养基III混合后的体积为30ml；固体培养基III的物理性能为：在温度上升到90℃时，固体培养基III从固态熔化为液态；而当温度下降时到40℃后，又从液态凝固成固态；

(3)将液态的固体培养基III放入加热恒温机恒温平衡区中的恒温杯卡孔8中降温，使液态的固体培养基III的温度降至42℃，此时，固体培养基III仍呈液态；

(4)将增菌培养后的液态增菌培养标本II放入加热恒温机恒温区中的恒温平衡区中的恒温杯卡孔8中，使其温度上升到42℃。

(5)将温度为42℃的液态固体培养基III和温度为42℃的液态增菌培养标本II倒入混合杯中混合，制成液态药敏试验标本IV。为了确保混合期间固体培养基III呈液态，混合杯应放入加热恒温机恒温区中的混合杯卡孔3中进行混合；

7、制作固态药检试验标本：

(1)将去掉盒盖13后的盒体10放入加热恒温机恒温区中的倒板卡槽2中，使其温度上升到42℃。；

(2)将液态药敏试验标本IV倒入盒体10中；

(3)盖上盒盖13，取出培养盒，放在常温下使液态药敏试验标本IV凝固，制成固态药检试验标本V；

8、将固态药敏试验标本V放入37℃的培养箱中培养，观察固态药敏试验标本的颜色，当颜色呈粉红色或淡黄色时，即可以进行下一试验步骤。

9、取掉盒盖13，向固态药检试验标本中滴入亚碲酸钾指示剂1ml，盖上盒盖；

10、将其放入37℃的培养箱中，观察抑菌圈，根据抑菌圈大小判断药物对细菌的作用效果。

本实施例中的液体增菌培养基I采用7H9。

本实施例中的固体培养基III与液体增菌培养基I混合配比比例为：每100ml7H9加一份固体培养基。每一固体培养基含卵黄液75ml，可溶性淀粉4.6g，L-酪蛋白0.25g，酚红4ml，琼脂糖1.25g，尿素0.2g，抑菌剂孔雀绿适量。

本实施例中的指示剂还可以选用亚碲酸钠。

本发明固体培养基III中的琼脂糖的作用是使药敏试验时的培养基凝固，除琼脂糖外，还可以用琼脂。

本发明中的固体培养基III的物理性能为：在常温下为固态；当温度上升直到低于熔化温度前仍为固态，当温度上升到高于熔化温度后，才熔化成液态；当温度下降直到高于凝固温度前仍为液态，当温度下降到低于凝固温度后，才凝固为固态。

本发明中的固体培养基III的熔化温度的选择标准为：①当固体培养基的温度上升达到熔化温度时，其中的营养成份不被破坏；②当固态药敏试验标本放入37℃的培养箱中培养时，药敏试验标本仍呈固态；③方便操作。因此，本发明中的固体培养基III的熔化温度选择为50℃-95℃。

本发明中的固体培养基III的凝固温度的选择标准为：①当固体培养基的温度下降达到凝固温度前，结核分枝杆菌与其混合时，其温度应为结核分枝杆菌能够存活的温度；②能较快达到37℃的结核分枝杆菌培养温度；③方便操作。根此，本发明中的固体培养基III的凝固温度选择为25℃-45℃。如果凝固温度太低就可能低于室温，特别在天气较热的时候，需要放入冷藏设备中才能凝固，不方便操作；同时，距37℃的结核分枝杆菌培养温度相距较大，不便于尽快达到结核分枝杆菌培养温度。如果凝固温度太高，不利于结核分枝杆菌的存活。

本发明的指示剂可以选用生长指示剂或生化反应指示剂。对生长指示剂的要求是：能够指示结核分枝杆菌生长繁殖并形成可观察的变色现象；可以选用MTT，XTT，Alamar-Blue。对生化反应指示剂的要求是：加入后能参与结核分枝杆菌特定生化反应中的某种生化反应，并形成可观察的变色等现象；可以选用尿素，亚碲酸钾，亚碲酸钠。

上述实施例中的指示剂选用的是尿素和亚碲酸钾，此外，还可以选用尿素、MTT、XTT、Alamar-Blue中的一种作为指示剂，其试验过程只有8个步骤，前面7个步骤相同，最后一个步骤为：将固态药敏试验标本放入37℃的培养箱中培养，观察抑菌圈，根据抑菌圈大小判断药物对细菌的作用效果。