miR-494抑制剂在制备抗骨钙丢失、促骨生成制剂中的应用

摘要

本发明涉及生物医学材料技术领域，是一种小RNA分子miR-494抑制剂在制备抗骨质丢失、促骨生成制剂中的应用。经实验证实，miR-494通过作用于成骨细胞分化相关的重要转录因子Runx2基因，抑制该基因不能表达相应蛋白，从而抑制成骨细胞的分化，引起成骨分化障碍，导致骨质丢失和骨质疏松的发生。miR-494的抑制剂能下调miR-494的表达丰度，解除miR-494对成骨分化的抑制作用、促进成骨，因而可将mir-494抑制剂用于制备抗骨质丢失、促骨生成制剂。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学材料技术领域，是一种小RNA分子miR-494抑制剂在制备抗骨钙丢失、促骨生成制剂中的应用。

背景技术

微小RNA(microRNA，简称miRNA)是生物体内源长度约为18-25个核苷酸的非编码小RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制。到目前为止，已报道有几千种miRNA存在于动物、植物、真菌等多细胞真核生物中，进化上高度保守。miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用(Ambros V.The functions of animal microRNAs.Nature.2004 Sep16；431(7006)：350-5.)。

与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻译水平上抑制其表达(哺乳动物中比较普遍)。然而，最近也有证据表明，这些miRNA也有可能影响mRNA的稳定性。使用这种机制的miRNA结合位点通常在mRNA的3’端非翻译区。如果miRNA与靶位点完全互补(或者几乎完全互补)，那么这些miRNA的结合往往引起靶mRNA的降解(在植物中比较常见)。通过这种机制作用的miRNAs的结合位点通常都在mRNA的编码区或开放阅读框中。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。

目前只有一小部分miRNAs生物学功能得到阐明。这些miRNAs调节了细胞生长，组织分化，因而与生命过程中发育、疾病有关。通过对基因组上miRNA的位点分析，显示其在发育和疾病中起了非常重要的作用。一系列的研究表明：miRNAs在细胞生长和凋亡，血细胞分化，同源异形盒基因调节，神经元的极性，胰岛素分泌，大脑形态形成，心脏发生，胚胎后期发育等过程中发挥重要作用。例如，miR-273和lys-6编码的miRNA，参与线虫的神经系统发育过程；miR-430参与斑马鱼的大脑发育；miR-181控制哺乳动物血细胞分化为B细胞；miR-375调节哺乳动物胰岛细胞发育和胰岛素分泌；miR-143在脂肪细胞分化起作用；miR-196参与了哺乳动物四肢形成，miR-1与心脏发育有关。另有研究人员发现许多神经系统的miRNAs在大脑皮层培养中受到时序调节，表明其可能控制着区域化的mRNA翻译。对于新的miRNA基因的分析，可能发现新的参与器官形成、胚胎发育和生长的调节因子，促进对癌症等人类疾病发病机制的理解。

但是目前尚未见关于miR-494抑制剂用于制备抗骨钙丢失、促骨生成制剂的任何报道。

发明内容

本发明的目的在于提供miR-494抑制剂用于抑制骨钙丢失、促骨生成的新用途。

本发明为实现上述发明目的，以模拟失重条件下成骨细胞出现骨分化障碍作为骨钙丢失的实验模型，首先采用荧光实时定量PCR技术检测了模拟失重环境下小鼠MC3T3-E1细胞miR-494的表达情况，结果发现在模拟失重24h后miR-494的表达量显著上调。进一步的研究结果表明，在正常环境下通过BMP2诱导具有成骨细胞分化潜能的小鼠C2C12细胞的过程中，miR-494的表达丰度明显下降。上述结果提示miR-494可能参与了对成骨细胞分化的抑制。

在此基础上，本发明将miR-494 mimics(miR-494模拟物)和miR-494inhibitor(miR-494抑制剂)转染入C2C12细胞后通过BMP2诱导成骨分化，通过检测成骨细胞分化的指标判断miR-494对细胞成骨分化的影响。研究结果发现，转染miR-494模拟物实验组，标志成骨分化的ALP表达量和活性均下调，OC、OPG、Runx2等分化指标也有明显下调；而转染miR-494抑制剂实验组，ALP、OC、Runx2表达上调，OPG无明显变化。上述研究结果表明miR-494可以抑制成骨细胞分化，引起骨钙丢失，而miR-494抑制剂则能促进成骨分化。

为了探讨miR-494抑制成骨细胞分化的可能分子机制，本发明结合国际上通用的3种miRNA靶基因预测软件(pictar，miRanda，Targetscan)对miR-494的潜在靶基因进行了预测，并从预测结果种筛选出了可能与miR-494抑制成骨细胞分化功能相关的候选靶基因——Runx2。之后本发明设计了相应的实验来验证Runx2是否是miR-494的靶基因。瞬时转染miR-494模拟物后发现Runx2在mRNA和蛋白水平均发生了显著降低，而转染miR-494抑制剂后，Runx2的表达水平有所升高，说明miR-494通过下调Runx2抑制成骨细胞分化，而其抑制剂可以促进成骨细胞分化、抑制骨钙丢失。

本发明的技术解决方案是：miR-494抑制剂在制备抗骨钙丢失、促骨生成制剂中的应用

附图说明

图1荧光实时定量PCR检测模拟失重C2C12细胞miR-494表达丰度图。

图2瞬时转染miR-494模拟物抑制成骨分化相关指标结果图。

图3miR-494抑制剂能增强成骨相关基因ALP活性的检测结果图。

图4miR-494抑制剂能增强成骨相关基因OC表达的ELISA检测结果图。

图5双荧光报告系统检测Runx2是miR-494靶基因结果图。

图6Westen blot验证Runx2是miR-494靶基因结果图。

具体实施方式

1.回转器模拟失重条件下的细胞培养

本发明中采用的细胞回转器具有两组不同方向的转台——水平转台和垂直转台，两组转台通过传动装置连接于同一个电机上实现同速旋转。水平转台在水平方向上旋转以模拟微重力，而垂直转台围绕与地面垂直的轴向旋转以在相同动力环境中作为1G对照，同时可以排除如振动等动力学因素的影响，本实验同时在37℃培养箱中设静止对照。含培养细胞的回转舱可以固定在转台上从而给予细胞模拟失重刺激或1G对照。

C2C12细胞在25cm²培养瓶中，采用含10％FBS DMEM培养液，在含5％CO2的37℃恒温培养箱中按常规培养。在进行模拟失重实验前一天，将细胞以每片1×10⁵个细胞的密度接种于2.5cm×3cm的盖玻片上(盖玻片预先经过多聚赖氨酸包被及灭菌处理)，将盖玻片置于六孔板中在5％CO2的37℃恒温培养箱中过夜培养。之后将接种有细胞的盖玻片插在固定架上，置于装满10％FBS DMEM培养液的回转舱中，排除气泡，密封舱口，回转器置于37℃恒温培养箱以30rpm旋转。细胞在不同重力环境培养48-72h后，进行后续实验。

2.细胞总RNA的提取

收获对数生长期的C2C12细胞约10⁷，加入1ml TRIZOL裂解细胞并用吸管反复吹吸，室温作用5min。将细胞转至1.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，盖紧离心管盖，漩涡振荡器上用力震摇15sec，室温放置3min，4℃以12,000×g的转速离心15min。将占总体积约60％的无色的上层水相转移至新的1.5ml管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温作用10min，12,000×g 4℃离心10min。弃去上清，加入1ml 75％乙醇洗涤(DEPC水配置)沉淀，震荡，4℃ 7,500×g离心5min，弃去上清，沉淀在37℃干燥5-10min，加入30μl DEPC水重新溶解，贮存于-70℃或直接使用。

3.miR-494表达丰度的检测

使用Applied Biosystem公司的小RNA试剂盒(Taqman MicroRNA Assay HumanPanel-Early Access Kit，P/N：4365409)，根据试剂盒操作手册的标准操作流程，使用荧光实时定量PCR技术检测模拟失重不同时间点miR-494的表达丰度值(Ct)，用miRNA-494的表达丰度值减去18sRNA(一种作为内参照的RNA)的表达丰度值得到标准化的表达丰度值(ΔCt)，之后使用GraphPad统计制图软件绘制图1所示的荧光实时定量PCR检测模拟失重C2C12细胞miR-494表达丰度图。

4.miR-494模拟物和miR-494抑制剂的体外合成

miR-494模拟物和miR-494抑制剂的体外合成由上海吉玛生物技术有限公司完成，miR-494模拟物、miR-494抑制剂及其相应对照序列如下：

5.细胞转染实验

转染前24小时，将适量细胞重新接种于T25培养瓶或6孔、24孔、96孔培养板中，贴壁细胞在长满底面积80％时进行转染。转染时，将适量RNA溶于无血清培养液，同时将Lipofectin 2000分散于等体积无血清培养液，并轻轻震摇5分钟，两液相混，放置20分钟。吸去细胞原培养液，换新鲜培养液(含或不含10％小牛血清)，将转染液缓缓加至培养液中，37℃孵箱转染6-8小时。最后弃去转染液，加入完全培养液继续培养。

6.成骨分化相关基因检测

将miR-494模拟物和对照NC转染入C2C12细胞后通过BMP2诱导成骨分化72h。收取细胞，提取细胞总RNA，按标准操作流程反转录合成cDNA。设计并合成针对成骨细胞特异基因的Real-time PCR引物，通过荧光实时定量PCR检测成骨分化相关基因的表达丰度。成骨细胞特异基因引物序列如下：(F，正向引物；R，反向引物)

检测结果表明，miR-494能显著抑制成骨细胞分化相关基因的表达(图2).

转染了miR-494抑制剂的细胞与对照细胞相比，无论是否使用BMP2刺激成骨，其成骨相关基因ALP的活性和OC的表达量均有明显提高，说明mir-494抑制剂能促进成骨、抑制骨质丢失(图3，图4)。

7.miR-494靶基因的预测

结合目前国际上通用的3种生物信息学分析预测软件(miRanda、PicTar和Targetscan)对miRNA-494的潜在靶基因进行预测，综合三种软件预测得到的多种潜在靶基因，以3种软件均预测得到的共同的潜在靶基因作为候选基因，结合上述候选基因已经报导的功能，从中进一步筛选出与成骨细胞分化密切相关的基因作为下一步验证实验的目标。本发明中筛选得到Runx2作为下一步验证实验的候选基因。

8.双荧光报告基因系统检测miR-494靶基因

将细胞以5×10⁴个/孔的密度接种于48孔板，每个处理准备3个复孔，第二天进行瞬时转染，方法按试剂说明进行。利用Promega公司PGL-3双荧光报告系统检测靶基因。将含有靶基因3’UTR的报告基因质粒转染细胞，每孔分别转染1μl RNA，0.05μg的报告基因质粒和0.05μg内参(pTKRL)质粒。转染24小时后吸弃每孔培养液，PBS洗涤1次，加入50μL Passive Lysis Buffer，室温裂解20min。分别收集每孔细胞样品。12,000rpm离心10分钟，TD 20/20照度计检测报告基因相对活性。比较不同报告基因间的相对活性差别。本发明中含有Runx23’UTR的报告基因与miR-494共转染后其报告荧光测量值显著下降(图5)，提示Runx2是miR-494的靶基因。

9.Western blot蛋白水平检测miR-494靶基因

将转染了miR-494模拟物及对照NC 48h的细胞消化收集。细胞样品行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用转移缓冲液平衡凝胶和硝酸纤维素膜15-30min，之后在100V电压下转移3h至硝酸纤维素膜上，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸。用TBST(10mM Tris·HCl pH 7.5，150mM NaCl)轻轻摇动洗涤5min，清洗两次。将硝酸纤维素膜浸在封闭液中，4℃过夜或在37℃下缓慢摇动封闭1h。将硝酸纤维素膜室温下浸在TBST缓冲液中，洗膜5min×2次。加入封闭液稀释的小鼠抗Runx2一抗，4℃过夜或室温下放置2h后TBST洗膜5min×3次，加入封闭液稀释的抗小鼠二抗，室温下放置1h后TBST洗膜5min×3次。化学发光法显色，显现目的条带后及时以X光片曝光、显影。Western blot检测结果显示，转染miR-494模拟物后，Runx2蛋白表达水平显著下降，这种变化在BMP诱导成骨细胞分化组更为明显(图6).

上述研究表明miR-494通过抑制成骨细胞分化相关的重要转录因子Runx2基因，抑制成骨细胞的分化，引起成骨分化障碍，导致骨质丢失和骨质疏松的发生。miR-494的抑制剂能下调miR-494的表达丰度，解除miR-494对成骨分化的抑制作用、促进成骨，因而可将mir-494抑制剂用于制备促进骨生成、抗骨质丢失、抗骨质疏松制剂。