一种从积雪草中制备积雪草总酸、积雪草酸、羟基积雪草酸的方法及所得制备物的用途

摘要

本发明涉及从积雪草中制备积雪草总酸、积雪草酸、羟基积雪草酸的方法及所得制备物的用途，其方法是首选用积雪草粗粉为原料制备积雪草总苷，再从积雪草总苷经碱液处理、酸化、正丁醇萃取、醇重结晶，制备积雪草总酸，再从积雪草总酸经层析分得积雪草酸、羟基积雪草酸，同时本发明还发现积雪草总酸、积雪草酸、羟基积雪草酸可用于降低餐后血糖及防治糖尿病，本发明方法具有工艺简单，成本低廉，便于推广，规模化生产的特点。

说明书

技术领域

本发明属于中药制备及用途技术领域，具体涉及一种从积雪草中制备积雪草总酸、积雪草酸、羟基积雪草酸的方法及所得制备物的用途。

背景技术

积雪草是中国药典收载的常用中药，是伞形科植物积雪草(Centella asiaticaLinn.)的全草，始载于《神农本草经》，列为中品，苦、辛、寒，归肝、脾、肾经，具有清热利湿，解毒消肿的功效。用于湿热黄疸，中暑腹泻，砂淋血淋，痈肿疮毒，跌打损伤。近年研究报道积雪草有促进伤口愈合，软化疤痕，抗牛皮癣，抗抑郁，抗乳腺增生，抗肝纤维化，抗癌，治疗水肿，保肝等作用。

积雪草的有效成分为积雪草总皂苷、积雪草酸、羟基积雪草酸等，目前，积雪草酸及羟基积雪草酸的制备方法主要是从积雪草原草中直接提取，由于积雪草中的积雪草酸和羟基积雪草酸含量很低，因此需要经过繁琐的萃取、层析等分离纯化过程才能获得，较为费时费力，而且消耗大量溶剂。曾经有报道，用积雪草皂苷制备积雪草酸，以使积雪草酸产量提高，但该方法以积雪草苷为原料，不能同时制备羟基积雪草苷。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种以积雪草粗粉为原料制备积雪草总酸、积雪草酸、羟基积雪草酸的方法，该方法不仅要从积雪草总苷中制备其中存在的少量积雪草酸和羟基积雪草酸，而且要把积雪草总苷中的积雪草苷和羟基积雪草苷转化为相应的积雪草酸和羟基积雪草酸。

本发明所要解决的技术问题之二在于提供利用上述方法所获得的制备物的用途。

本发明涉及的积雪草苷(1)，羟基积雪草苷(2)，积雪草酸(3)，羟基积雪草酸(4)的化学结构式如下：

作为本发明第一方面的从积雪草中制备积雪草总酸、积雪草酸、羟基积雪草酸的方法，具体包括如下步骤：

a、积雪草总皂苷的提取：将积雪草粗粉用提取溶剂提取，所得提取溶液经第一次减压浓缩，加入沉淀剂进行沉淀，随后过滤，滤液经第二次减压浓缩至干得到积雪草总皂苷；

b、积雪草总酸的制备：将积雪草总皂苷倒入碱性水解液中进行搅拌水解得到水解液，水解液随后加乙酸乙酯分配，分配后得到的水层用稀矿酸中和，中和后的水溶液进行浓缩形成浓缩液，浓缩液用正丁醇萃取，所得萃取液经少量水反洗，减压浓缩至干，得到积雪草总酸粗品，所述积雪草总酸粗品经活性碳脱色，用醇重结晶得到积雪草总酸；

c、积雪草酸及羟基积雪草酸的制备：对积雪草总酸进行柱层析，先后得到积雪草酸和羟基积雪草酸。

其中a步骤中所述的提取溶剂可以是水或者低级醇，选择水或者低级醇作为提取溶剂可以使积雪草中的有效成分尽量被提取，达到充分利用原料的目的。所用的提取方式可以是本领域常见的提取技术，例如，技术人员可以将提取溶剂与积雪草粗粉混合后回流提取的形式进行提取，至于提取次数通常2～3次，提取时间通常1.5～2h。当a步骤中的提取溶剂为低级醇时，提取溶剂为重量百分比浓度30％～70％乙醇或重量百分比浓度30％～70％甲醇。

另外，由于有效成分在低级醇中的溶解性大，故a步骤中使用低级醇作为沉淀剂，可使有效成分与水溶性杂质如多糖和无机盐等有效分离。所述低级醇为甲醇或乙醇，优选为乙醇。

本发明在a步骤中对所得提取溶液进行第一次减压浓缩至浓缩液比重为1.1～1.3。

本发明在b步骤中所使用的碱性水解液为无机碱溶液，所述无机碱溶液是质量百分比浓度为0.5％～2.0％氢氧化钾或氢氧化钠水溶液。

本发明在b步骤中，水解的温度一般为55℃～65℃，水解时间为2～3小时，碱性水解液的用量一般为积雪草总皂苷重量的4～8倍，本发明采用这样的水解条件以确保水解完全。

本发明在b步骤中所使用的稀矿酸可以是常用的稀盐酸或稀硫酸。

作为一种优选条件，本发明在c步骤中的柱层析所用层析硅胶的重量可以是积雪草总酸重量的20～30倍，所用洗脱剂可以是氯仿与甲醇的混合液，氯仿与甲醇的体积比为5∶1。

综上所述，本发明所述的一种从积雪草中提取积雪草总酸、积雪草酸、羟基积雪草酸的方法，其是利用积雪草总皂苷经碱液水解后得到总三萜酸，再经硅胶层析分得主要的两个三萜酸-积雪草酸、羟基积雪草酸。本发明方法工艺简单，仅需完成常规提取，萃取，柱层析等常规操作，省事省力，所用试剂也仅仅是些低级醇，成本低廉，利于推广。

另外，本发明经研究，还发现积雪草中的有效成分积雪草总酸、积雪草酸、羟基积雪草酸具有降低餐后血糖及防治糖尿病的功效，其原理是通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性而产生功效。

具体实施方式

实施例1

下面对本发明做进一步的说明：

积雪草总皂苷的提取：

全草粗粉1Kg，加10立升水回流提取三次，每次1.5小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至比重1.1，加三倍体积的95％酒精沉淀，放置过夜，过滤，滤液减压浓缩至干，得51g，即为积雪草总皂苷，得率5.1％。

同样用全草粗粉1公斤，加10立升60％酒精回流提取三次，每次1.5小时，以下同上操作，得总皂苷56g，得率5.6％。

积雪草总酸的制备：

用上述积雪草总皂苷51g，加200ml 1％氢氧化钾溶液，在60℃水浴加热并搅拌2小时，放冷后碱性水解液用乙酸乙酯分配2次，每次乙酸乙酯用80ml。碱水层用稀盐酸调pH＝7后，减压浓缩至100ml，用正丁醇萃取三次(每次25ml)，合并正丁醇层，再用少量水反洗一次后，将正丁醇层减压蒸干，得粗积雪草总酸，用少量甲醇加热溶解后，活性碳脱色，过滤，回收甲醇至小体积，放置，析晶，过滤，结晶用少量丙酮洗，得积雪草总酸13g，得率1.3％。

积雪草酸及羟基积雪草酸的制备：

将上述积雪草总酸10g溶于甲醇，拌20g层析硅胶(200～300目)，干后置于装有500g硅胶的层析柱上，用氯仿与甲醇的混合溶剂洗脱，其体积比为5∶1，每份收集80ml，薄层色谱(TLC)跟踪检侧，合并相同流份，先后分得积雪草酸1.2g，羟基积雪草酸3.7g。

所分得的积雪草酸及羟基积雪草酸经熔点、薄层色谱(TLC)Rf值、及HPLC保留时间与对照品的相一致，并它们的¹³CNMR数据与文献的相一致而进一步确认。

α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用测定：

(1)试剂

阿卡波糖对照品购自上海史瑞可生物有限公司，α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，TypeI；from bakers Yeast)、4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG)均购自Sigma公司；药材购自上海汇丰大药房；其余试剂均为分析纯。

(2)仪器

HWS26型电热恒温水浴锅，PHS-25酸度计，DL-5低速大容量离心机，循环水式多用真空泵SHB-IIIA，旋转蒸发仪RE52-98，上海棱光S54 PC紫外可见分光光度计。

(3)α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

以4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物，向反应体系为2ml0.1mol/L pH＝6.8的磷酸盐缓冲液中加入待测样品100μl(样品按指定量用50％DMSO溶解)、1mg/ml的还原谷胱甘肽50μl和5.7U/ml的α-葡萄糖苷酶100μl，摇匀后37℃温浴10分钟；然后加入37℃温浴好的20mmol/L的底物PNPG200μl，37℃水浴反应20min后，加入0.1mol/L Na₂CO₃溶液10ml终止反应，在波长400nm处测定吸光度。阳性对照为5mg/ml的阿卡波糖。α-葡萄糖苷酶抑制活性计算公式如下：

上式中：A_空白为不加样品反应后的吸收值，A_样品为加入样品反应后的吸收值，A_背景为只加样品的吸收值。

表1反映了积雪草总酸、积雪草酸、羟基积雪草酸对α-葡萄糖苷酶活性的抑制百分率：

表1

积雪草为常用中药，其富含积雪草皂苷类成分，从积雪草总皂苷水解得积雪草总酸，再从积雪草总酸中分得积雪草酸、羟基积雪草酸两个成分，本发明首次发现积雪草总酸、积雪草酸、羟基积雪草酸对α-葡萄糖苷酶活性有很强的抑制作用。由于积雪草药源丰富，价廉，提取及转化、分离工艺简单，既安全又经济，因此便于推广规模化生产，可开发成防治糖尿病、抗癌药物。

应当理解，在阅读了本发明的讲授上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。