EPI－HNE蛋白质悬浮液,其制备方法,其派生的干粉气溶胶,含有所述悬浮液或气溶胶的药物组合物及其应用

摘要

本发明涉及一种EPI－hNE蛋白质晶体颗粒悬液，制备所述悬液的方法，所述悬液派生的干粉气溶胶，含有所述悬液或所述气溶胶的可吸入药物制剂，以及所述可吸入药物制剂在治疗各种病理症状中的应用。

说明书

本发明涉及一种EPI-hNE蛋白质晶体颗粒悬浮液，制备所述悬浮液的方法，所述悬浮液派生的干粉气溶胶，含有所述悬浮液或干粉气溶胶的可吸入药物制剂，以及所述可吸入药物制剂在治疗各种病理症状中的应用。

LEY等人的国际专利申请WO 96/20278描述了数个通过基因工程方法获得的可抑制人中性粒细胞弹性蛋白酶(hNE)的蛋白质。正如上述专利申请中所指出，人中性粒细胞弹性蛋白酶(亦称为人白细胞弹性蛋白酶)是多形核白细胞嗜苯胺蓝颗粒中的主要中性蛋白酶之一。这个酶与消除病原体以及结缔组织的重建有关。

hNE主要的系统性抑制剂为α-1-蛋白酶抑制剂，从前称作α1抗胰蛋白酶。在某些病理状态下(遗传性疾病，慢性支气管炎，肺气肿，膀胱纤维变性)，这种抑制剂或是在血流中存在的量不足，或是失去了活性，从而导致了hNE促弹性纤维水解的活性失控，由此引起肺组织的大范围损害。

WO 96/20278于是提出了一些作为稳定，无毒性，高效能的hNE抑制剂的新蛋白质。这些抑制剂构成了衍生于Kunitz型抑制结构域的一组抑制剂的一部分，而Kunitz型抑制结构域见于基础胰蛋白酶抑制剂(BPTI)或一种称为人Inter-α-胰蛋白酶抑制剂(ITT)轻链的人源蛋白质。它们特别是EPI-hNE-1，EPI-hNE-2，EPI-hNE-3及EPI-hNE-4。WO 96/20278中的抑制剂系通过生物技术方法制成，并在Kunitz生物功能域上含有经修饰的DNA序利，从而使它们具有高度活性。这些抑制剂之一，EPI-hNE-4，是特别的令人感兴趣的。

WO 96/20278描述了如何构建巴斯德毕赤酵母生产系统以进行hNE抑制剂EPI-hNE-1，EPI-hNE-2，EPI-hNE-3及EPI-hNE-4，蛋白质的生产和纯化(见具体实施例10-15)

含有非功能性组氨醇脱氢酶基因(his4)的巴斯德毕赤酵母突变株GS115被表达质粒所转化。该质粒含有一段编码啤酒酵母交配因子α-前肽序列；而α-前肽序列在上游可诱导的巴斯德毕赤酵母aoxl基因启动子和下游aoxl转录终止及聚腺苷化序列控制下，直接融合于所需的hNE抑制剂的氨基末端。该表达质粒以SacI消化后成为线状，而该线状DNA经同源重组掺入巴斯德毕赤酵母GS115菌株基因组中，发生原生质球转化，选择能在缺乏加入组氨酸条件下生长的菌落并筛选具有甲醇利用表型，分泌水平和基因剂量(用Southern杂交法估算)较高的母菌。选出估计含有约四个拷贝以串联排列整合于aoxl基因位点的表达质粒的菌株。

选到的菌株首先以甘油为碳源成批培养，甘油耗尽后以限量添加甘油方式进一步扩增细胞量并抑制aoxl启动子，最后以限量添加甲醇方式培养。后期让aoxl启动子充分显示活性，蛋白质即分泌到培养液中。

然后纯化EPI-hNE蛋白质。具体纯化工序视各蛋白质特性的不同而不同。简而言之，离心培养液，上清液作微孔过滤然后超滤或渗滤，再以硫酸铵沉淀和离子交换层析回收蛋白质。

欧洲专利申请00203049.2号及国际专利申请PCT/FR 01/02699已由申请者公司备案，其在优先权请求中描述了一种从宿主菌株培养液中纯化符合药用质量的EPI-hNE蛋白质的改进工序，包括以下步骤：

(a)使培养液的一部分通过扩张的阳离子交换床，回收洗脱液；

(b)根据蛋白质疏水性质的差别对洗脱液作蛋白质分离；

(c)使洗脱液通过阳离子交换柱；

(d)或者在无菌条件下过滤所得培养液，以及

(e)或者冷冻干燥所得滤液以回收EPI-hNE蛋白质。

经步骤(d)后获得的溶液或其后获得的冻干粉可用以制备本发明的悬液，所述悬液能加入本发明的可吸入药物配方中。

申请该专利的公司完善了EPI-hNE蛋白，特别是EPI-hNE-4，的纯化方法，后来又投入了大量的探索和努力来开发含有纯化EPI-hNE蛋白的药物组合物。

事实上该专利申请公司致力于开发含有EPI-hNE-4溶液的口腔吸入药物组合物。然而，在产品开发过程中他们发现EPI-hNE-4溶液一旦装入雾化器即变得不稳定而且趋向于沉淀，从而使溶液变成浑浊。

起初认为蛋白质沉淀形式不具有治疗活性。然而令人惊讶并出乎意料的是，发现该沉淀形式是EPI-hNE-4蛋白质的结晶形式，结晶对该蛋白的活性没有不良影响。本文的术语“结晶形式的EPI-hNE-4”意为该蛋白质的不可溶形式，具有棒状结构，粒子大小一般小于10微米。

于是，该专利申请公司将努力方向转向开发一种结晶形式的EPI-hNE蛋白质悬液，所述悬液能够加入到药物组合物中，具体是用于吸入的药配方中。

令人惊奇的是发现有可能制成一种在特定浓度和pH条件下室温稳定的悬液，从而得以制备含有在室温下稳定的所述悬液的药物制剂。这种室温稳定性在移动治疗中尤为重要。

使用EPI-hNE蛋白质悬液取代其溶液最主要的好处体现在可制备吸入型药物制剂，在此基础上可以开发出活性成份更浓的制剂，从而能缩短给药时间。

这在吸入剂给药中是一个重要的因素，因为吸入过程的时间往往要求较长，被认为是一种严重的强制措施，可能导致病人顺从性差。

本发明涉及一种EPI-hNE蛋白质悬液，所述悬液的特征为EPI-hNE蛋白质以结晶粒子形式存在，经激光粒度计测量其颗粒大小主要介于1-6微米特别是3-6微米之间，该悬液的EPI-hNE蛋白质浓度介于1-80mg/ml，以2-50mg/ml更佳，主要取决于治疗状况所需要的EPI-hNE蛋白质的量；其水相运载体pH介于3-8之间，以4-6更佳，pH4.0-5.0之间最好。

上述悬液在室温下生物学活性及颗粒大小分布至少可保持两个月稳定。

水相运载体以等渗生理盐水为较适宜。

生理盐水可含醋酸钠和氯化钠或柠檬酸钠。

EPI-hNE蛋白质选自EPI-hNE-1，EPI-hNE-2，EPI-hNE-3及EPI-hNE-4为宜，以EPI-hNE-3或EPI-hNE-4较好，最好是EPI-hNE-4。

上述悬液最好含有至少65％的EPI-hNE-4晶体颗粒，激光粒度计测定的颗粒大小应在3-6微米之间。

该悬液中被吸入物质的量经Pari LC-star气雾测定仪测定为约40-50％，正是一个吸入型药剂的理想值。

经撞击式粒度计测定含有EPI-hNE-4结晶颗粒的雾滴的MMAD(质量气体动力直径中值)值约为2微米。这个MMAD值很适合保证一个高的吸入组分以及有效地穿透进入肺部。

从上述的悬液还可制成干粉，如将悬液pH调节到3.5-4.5后进行离心，分去上清液，温和条件下真空干燥沉淀部分，然后经匀化处理使颗粒从聚集状态分散开来。在这些条件下获得了球形颗粒，经直接显微镜检查大多数颗粒大小或直径在1-6微米之间。经激光粒度计对溶液的测定，干粉的粒子大小分布与悬液中的相当。

干粉也可得自EPI-hNE蛋白质溶液，或是EPI-hNE蛋白质的冻干粉末。

本发明同样还涉及到一种干粉，经直接显微镜检查，它含有EPI-hNE-4球形颗粒，大小或直径大多数在1-6微米之间，以至少75％颗粒的大小或直径在1-3微米之间为佳；以激光粒度计测定，颗粒的大小或直径大多数在1-6微米之间，以至少60％颗粒的大小或直径在1-3微米之间为佳。这种干粉通过适当的方法获得，该方法包括的步骤有：在上述EPI-hNE蛋白质悬液中从液相分离出晶体，去除残留的水份，匀化得到的易碎的结块。

本发明还涉及到一种含EPI-hNE-4球形颗粒的干粉，激光粒度计测定其至少90％的颗粒大小或直径在0.5-4.0微米之间，MMAD值约2.1微米。当该粉末被分散到适宜的助推剂中时这个MMAD值很适合保证一个高的吸入组分和有效地穿透进入肺部。这种干粉可以通过包括喷雾干燥EPI-hNE蛋白质溶液步骤的方法很方便地得到。

本发明还涉及到一种含有上述EPI-hNE-4蛋白质悬液的可吸入的药物制剂，或者一种含有上述干粉和适宜助推剂的干粉气雾剂。

本发明还进一步涉及从EPI-hNE蛋白质溶液或从冻干粉制备EPI-hNE蛋白质悬液的方法。

如果从EPI-hNE蛋白质溶液起始制备该悬液，适当的方法包括以下步骤：

(a)将溶液的pH调到3.5-4.5之间以利于EPI-hNE蛋白质形成结晶，及

(b)将pH值调到3.0-8.0之间。

以上步骤(a)和(b)可在1-40℃温度下实施，以4-30℃更好。

如果从冻干粉起始制备该悬液，适当的方法包括以下步骤：

(b)将EPI-hNE蛋白质溶解于pH值低于3.0的缓冲液中

(c)将溶液的pH值调到3.5-4.5之间以利于EPI-hNE蛋白质形成结晶，及

(c)将pH值调到3.0-8.0之间。

以上步骤(a)，(b)和(c)可在1-40℃温度下实施，以4-30℃更好。

本发明还涉及了从上述EPI-hNE蛋白质悬液、溶液或从冻干粉起始制备上述干粉的方法。

如果从EPI-hNE蛋白质悬液起始制备干粉，该方法包括的步骤有：例如以离心或亚微孔过滤器过滤，从上述EPI-hNE蛋白质悬液的液相中分离出晶体，适当采用不会导致固相广泛干固结块的方法去除残留水份，例如在40℃以下温度以略低于大气压的条件温和蒸发干燥，再用本领域熟知的适当研磨工艺，如Fritsch的5号磨碎机(Pulverisette 5)(行星式轧机)，或者巴黎Moderne实验室的电动研磨装置Moulin JK，匀化得到的固体干块，使颗粒从聚集状态分散开来。

如果从EPI-hNE蛋白质溶液起始制备干粉，适当的方法包括以下步骤：

(a)将溶液的pH调到3.5-4.5之间以利于EPI-hNE蛋白质形成结晶

(b)例如以离心或亚微孔过滤器过滤的方式，从上述悬液的液相中分离出晶体，

(c)适当采用不会导致固相广泛干固结块的方法去除残留的水份，例如在40℃以下温度以略低于大气压的条件温和蒸发干燥

(d)再用本领域熟知的适当研磨工艺匀化得到的固相干块，使颗粒从聚集状态分散开来。

以上步骤(a)和(b)可在1-40℃温度下实施，以4-30℃更好。

如果从EPI-hNE蛋白质溶液起始制备，较好的方法包括喷雾干燥该溶液的步骤。可以很方便地调节此步骤中的参数，使得粉末分散到适宜的助推剂中时能保证适合的颗粒大小分布，继而保证一个高的吸入组分和有效地穿透进入肺部。

如果从EPI-hNE蛋白质冻干粉起始制备干粉，适当方法包括以下步骤：

(a)将EPI-hNE蛋白质溶解于pH值低于3.0的缓冲液中

(b)将溶液的pH值调到3.5-4.5之间以利于EPI-hNE蛋白质形成结晶

(c)宜以离心或亚微孔过滤器过滤从上述悬液的液相中分离出晶体，

(d)适当采用不会导致固相广泛干固结块的方法去除残留的水份，以在40℃以下温度并略低于大气压的条件温和蒸发干燥为好

(e)再用本领域熟知的适当研磨工艺匀化得到的固体干块，使颗粒从聚集状态分散开来。

以上步骤(a)和(b)可在1-40℃温度下实施，以4-30℃更好。

本发明还涉及应用上述EPI-hNE蛋白质悬液或干粉气雾剂制备药物用以治疗因hNE活性过高所致疾病。

这些疾病可能特别是任何呼吸性疾病，或者是选自膀胱纤维变性、肺气肿、ARDS(急性呼吸窘迫综合征)和COPD(慢性阻塞性肺部疾病)的病例。

以下实施例可以更好地描述本发明，但绝不应被认作是限制性的。

参见图1到图3B可以更好地理解以下描述。

图1是EPI-hNE-4蛋白质悬液离心后获得的沉淀物的显微图像，显示EPI-hNE-4晶体在水中的棒状结构。

图2是粒径约2.5微米雾滴的显微图像，该雾滴含有棒状EPI-hNE-4结晶颗粒。

图3A和3B是干粉的显微图像，显示在干燥形态下EPI-hNE-4颗粒的球形结构。

实施例1

EPI-hNE-4的纯化

酵母生产体系

hNE抑制剂的生成系经高细胞浓度的巴斯德毕赤酵母GS115菌株发酵，形成分泌到培养上清液中的蛋白质。

表达质粒的构建，是通过将一段编码啤酒酵母交配因子α-前肽的合成DNA序列直接连接到编码所需hNE抑制剂的合成DNA的5’末端。将这个融合基因夹在上游可诱导性巴斯德毕赤酵母aoxl基因启动子与下游aoxl转录终止及聚腺苷化序列之间；位于也编码啤酒酵母his4基因的一质粒上。

将线性化的表达质粒DNA通过同源重组掺入到巴斯德毕赤酵母GS115菌株的基因组中发生原生质球转化。在缺乏加入组氨酸条件下选择再生的原生质球中能生长的菌落筛选单个分离株中具有甲醇利用表型(mut+)、分泌水平及基因拷贝数较高的菌株。于是选出了一个EPI-hNE-4高水平分泌株PEY-53。这个菌株据基因组DNA的Southern杂交分析估计含有四个拷贝整合于aoxl基因位点的表达质粒DNA。

蛋白质的生产

巴斯德毕赤酵母PEY-53菌株以混合养料发酵培养，程序类似于WO 96/20278中所描述，不同之处在于用压缩空气取代了纯氧。简单地说，先以甘油为碳源进行成批培养，甘油耗尽后以限量添加甘油方式，培养约四小时以进一步扩增细胞量并抑制aoxl启动子。在生产的最后阶段以限量添加甲醇方式培养。在这个阶段aoxl启动子充分显示活性，hNE抑制剂被分泌到条件培养液(CM)中。在PEY-53发酵CM中，经SDS-PAGE分析和反相HPLC分析，EPI-hNE-4的最终浓度为约1000mg/l。PEY-53培养物产生的主要分子种类为已适当加工的EPI-hNE-4蛋白质。然而，该菌株还分泌约5-20％的分子量略高的一种蛋白质，推测其代表经过另一种加工的EPI-hNE-4蛋白质。如下所述，基本上纯化正确加工的EPI-hNE-4蛋白质去除污染物。

如实施例1所述得到PEY-53 CM 100升，收集并按如下过程通过扩张床：10升层析基质(Streamline SP，Amersham-Pharmacia)用pH3.5，50mM醋酸铵平衡，再以同一缓冲液在300cm/小时流速下流化至30升。上样后用pH3.5，10mM醋酸铵洗柱，直到280nm吸收值低于0.05。将珠状基质装填至10升，用pH4.5，1M醋酸铵缓冲液洗脱回收EPI-hNE-4蛋白质。

于是就获得了含有约100克EPI-hNE-4的10升溶液(根据280nm分光测定、反相HPLC、Coomassie蛋白质试验和生物活性试验测定)。

反相HPLC(Pharmacia的Licrosphere 100RP硅胶柱/水+1％TFA和乙腈+1％TFA之间的梯度)显示另一种加工形式的蛋白不能与正确形式的蛋白分开。也可检测到绿色的污染物。

将此溶液用22微米过滤器(Millipore的Millipack 200)进行无菌过滤，然后进一步纯化。

使上述10升溶液通过BioProcess(Pharmacia)系统，进行疏水反应层析，其中采用Pharmacia的苯基琼脂糖凝胶快速流动基质和15升的BPTG层析柱。使用的缓冲液有A：pH4.5，50mM醋酸钠+1M氯化钠；B：pH4.5，50mM醋酸钠。以100％的B液进行一步洗脱，流速300cm/小时。

洗脱液中含有大约50克纯化的EPI-hNE-4(根据280nm分光、Coomassie蛋白质试验和生物活性试验测定)。

反相HPLC显示另一种加工形式的蛋白未被分离掉。未测见绿色色素污染。

此后用Pharmacia的BioProcess层析系统进行阳离子交换层析。使用的层析介质为BioRad的Macroprep High S型基质(基于载有磺酸盐表面基团的交联丁烯酸酯的刚性基质)，层析柱为Pharmacia的15升BPG200型柱。使用的缓冲液有A：pH3.5、10mM醋酸铵；B：pH6.2、50mM醋酸钠；和C：pH7.8、10mM碳酸氢铵。先用缓冲液B洗脱分离去掉错误加工形式的蛋白。然后用100％B液进行一步洗脱，流速300cm/小时。

洗脱液中含有大约40克纯化的EPI-hNE-4(根据280nm分光、Coomassie蛋白质试验和生物活性试验测定)，相当于纯化工序总产量的40％。

反相HPLC显示非正确加工形式的蛋白低于1.5％。未测见绿色色素污染。

冷冻干燥洗脱液并保存于-20℃。

实施例2

EPI-hNE-4配方的制备

从实施例1中得到的EPI-hNE-4冻干粉起始，按下述方法制备了12批EPI-hNE-4悬液。

配方10/4：以pH4.0醋酸铵和氯化钠溶液配成10mg/l的EPI-hNE-4悬液。

配方10/5：以pH5.0醋酸铵和氯化钠溶液配成10mg/l的EPI-hNE-4悬液。

配方5/4：以pH4.0醋酸铵和氯化钠溶液配成5mg/l的EPI-hNE-4悬液。

配方5/5：以pH5.0醋酸铵和氯化钠溶液配成5mg/l的EPI-hNE-4悬液。

配方2.5/4：以pH4.0醋酸铵和氯化钠溶液配成2.5mg/l的EPI-hNE-4悬液。

配方2.5/5：以pH5.0醋酸铵和氯化钠溶液配成2.5mg/l的EPI-hNE-4悬液。

配方20/4(4℃)：以pH4.0醋酸铵和氯化钠溶液配成20mg/l的EPI-hNE-4悬液，在4℃制备。

配方20/4(30℃)：以pH4.0醋酸铵和氯化钠溶液配成20mg/l的EPI-hNE-4悬液，在30℃制备。

配方30/4(4℃)：以pH4.0醋酸铵和氯化钠溶液配成30mg/l的EPI-hNE-4悬液，在4℃制备。

配方30/4(30℃)：以pH4.0醋酸铵和氯化钠溶液配成30mg/l的EPI-hNE-4悬液，在30℃制备。

配方50/4(4℃)：以pH4.0醋酸铵和氯化钠溶液配成50mg/l的EPI-hNE-4悬液，在4℃制备。

配方50/4(30℃)：以pH4.0醋酸铵和氯化钠溶液配成50mg/l的EPI-hNE-4悬液，在30℃制备。

制备EPI-hNE蛋白质结晶颗粒悬液的通用方法

2.5，5及10mg/l的EPI-hNE-4悬液的制备

pH3.0浓度15mg/ml的EPI-hNE-4溶液制备如下：将140mg粉末状的EPI-hNE-4溶解于7ml pH3.0的10mM醋酸钠缓冲液中。用1M盐酸(HCl)调节pH到2.0。溶解后此溶液用一个MediaKap 5型过滤器过滤，用1M氢氧化钠(NaOH)调节pH到3.0。

以紫外分光法检测蛋白质浓度，溶液用10mM醋酸钠稀释至浓度为15mg/ml。

加入PH12的10mM醋酸钠，2.4％氯化钠溶液一半体积得到10mg/ml、pH4.0的EPI-hNE-4溶液。必要时可用1M的盐酸或1M的氢氧化钠调节pH至4±0.1。

将溶液转至一玻璃容器中，置室温过夜使其结晶。

取一份50微升的样品离心，取沉淀物作相差显微镜分析。

图1显示该沉淀物棒状结构的EPI-hNE-4晶体的显微图像。

将此悬液匀化后，取一半体积转入另一玻璃容器中并用1M的氢氧化钠将pH调至5.0。将由此所得的pH4.0和pH5.0的悬液分别按需反复稀释直到达到5mg/ml和2.5mg/ml的浓度。

20，30及50mg/l的EPI-hNE-4悬液的制备

分别从30，45及75mg/l的EPI-hNE-4溶液起始，配方20/4(4℃)、20/4(30℃)、30/4(4℃)、30/4(30℃)、50/4(4℃)及50/4(30℃)的制备基本上与上述过程相同，所有步骤在4℃或30℃下进行，溶液放置72小时使之结晶。未发现这两个温度之间在结晶动力学上有显著差异。

实施例3

EPI-hNE-4悬液的激光粒度计分析

用Coulter Multisizer II对实施例2中制得的EPI-hNE-4悬液中的粒子作颗粒度分析。下表1中列出了部分测试结果。

                       表1

 [EPI-HNE-4]    mg/ml    pH    颗粒大小或直径在3-6微米之间的颗粒百分比    10    4.0    67.25    10    5.0    65.65    5    4.0    69.27    5    5.0    68.55    2.5    4.0    71.13    20(4℃)    4.0    87.3    20(30℃)    4.0    84.2    30(4℃)    4.0    85.1    30(30℃)    4.0    89.0    50(4℃)    4.0    85.6    50(30℃)    4.0    87.8

上表显示在每一种悬液中至少65％的颗粒直径在3-6微米之间。

实施例4

EPI-hNE-4悬液的生物活性测定方法

通过比色法测定人中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制水平证实了EPI-hNE-4悬液的生物活性。

人弹性蛋白酶可水解合成底物N-甲氧基琥珀酰-ala-ala-pro-val-对-硝基苯胺。

水解时产物对-硝基苯胺(黄色)被释放出来。

于是EPI-hNE-4的生物活性，即对人弹性蛋白酶的抑制水平，可以通过对-硝基苯胺释放的降低计算出来。

制备各种稀释度的EPI-hNE-4悬液，用紫外分光法标定其中特异性蛋白的浓度。使用的稀释液为Tris 100mM，NaCl 50mM，Triton X100 0.25％，BSA 0.1％，pH8.0。将100微升的100nM EPI-hNE-4液加到5毫升的试管中。再加入以同样缓冲液配的100微升的100nM hNE。将稀释样品室温保温15分钟(不需搅拌)。加入100微升4.2mM的底物(如前所述)，37℃温育反应混合物15分钟。加入50微升冰醋酸终止反应。以单纯缓冲液和不含EPI-hNE-4的hNE样品作为对照，测定410nm波长吸收值。

实施例5

EPI-hNE-4悬液的稳定性

为了验证其稳定性，对三种pH5.0、EPI-hNE-4浓度分别为2.5，5及10mg/ml的悬液，和三种pH4.0、EPI-hNE-4浓度分别为20，30及50mg/ml的悬液作了为期两个月的颗粒大小分布和抑制活性分析。

悬液按照实施例2中列出的方法制备。将pH4.0、EPI-hNE-4浓度分别为2.5，5及10mg/ml 3种的悬液各取三小瓶室温放置两个月；将pH4.0、EPI-hNE-4浓度分别为20，30及50mg/ml的三种悬液各取三小瓶4℃放置两个月。

在两个月开始和结束时分别按实施例4所述的比色方法，作人中性粒细胞弹性蛋白酶抑制试验测定悬液的生物活性。在两个月期限的开始和结束之间未发现有显著差别。

在两个月开始和结束时用Coulter Multisizer II对粒子的大小分布作激光颗粒度测定。pH5.0、EPI-hNE-4浓度10mg/ml的悬液经两个月室温放置后其颗粒大小分布未发生明显改变。

pH5.0、EPI-hNE-4浓度10mg/ml的悬液，经十个月室温放置后，其颗粒大小分布及EPI-hNE-4的抑制活性未显示任何显著变化。

实施例6

EPI-hNE-4悬液的雾化。雾滴大小分布的分析及显微观察

将实施例2制得的悬液用Pari LC-star喷射雾化器进行雾化。

可吸入物质的量经本领域熟知的方法测定为约40-50％，正是一个吸入型药剂的理想值。

用Coulter Multisizer II对雾化颗粒的大小分布作激光颗粒度分析。其MMAD值为3-4微米。

按本领域熟知的程序，用撞击式粒度计在8.0微米、6.0微米、4.0微米、3.0微米、2.0微米、1.5微米、1.0微米、0.75微米、0.5微米和0.25微米的系列过滤器上测定雾化颗粒的大小分布。每一种被测的悬液MMAD值约为2微米。

图2是粒径约2.5微米雾滴的显微图像，该雾滴含有棒状EPI-hNE-4结晶颗粒。

实施例7

干粉的制备，所述干粉的显微观察分析和其生物活性测定

pH3.0、浓度15mg/ml的EPI-hNE-4溶液制备如下：将140mg粉末状的EPI-hNE-4溶解于7ml pH3.0的10mM醋酸钠缓冲液中。用1M盐酸(HCl)调节pH到2.0。溶解后此溶液用一个MediaKap 5型过滤器过滤，再用1M氢氧化钠(NaOH)调节pH到3.0。

以紫外分光法检测蛋白质浓度，溶液用10mM醋酸钠稀释至浓度为15mg/ml。

加入P12的10mM醋酸钠2.4％氯化钠溶液一半体积，得到10mg/ml、pH4.0的EPI-hNE-4溶液。必要时可用1M的盐酸或1M的氢氧化钠调节pH至4±0.1。

将溶液转至一玻璃容器中，置室温72小时使其结晶。

此悬液以0.22微米过滤器过滤。回收过滤器，在装有蓝色硅胶的干燥器内(可使水份逐渐挥发的系统)干燥过夜。从过滤器上回收到一个易碎的粉块。用一个研钵作简单的手工机械匀化，从而产生一种表观均匀的极细粉末。

把这种粉末放在Thomas平板上作直接显微镜观察。图3A是此粉末的显微图像，显示干燥形式的EPI-hNE-4的不规则球形结构，其中大部分单个颗粒的直径或颗粒大小在1-6微米之间。显微图像中的暗区可能代表着单个粒子的重叠或手工均化不彻底样品残留的聚集物。

对直接显微镜检查Thomas平板显微图像测得的单个颗粒直径(球形粒子最大和最小直径的平均值)作统计学分析显示，大部分(80％以上)颗粒的直径(或颗粒大小)介于1-6微米之间，至少75％的颗粒其直径(或颗粒大小)介于1-3微米之间。直径(或颗粒大小)的中值约为2.1微米，平均直径(或颗粒大小)为2.33±0.18微米。

将粉末分散在1％氯化钠溶液中并用Coulter Multisizer II作激光颗粒度分析。  对激光颗粒度数据作完全统计学分析显示，其颗粒大小分布与实施例3中获得的结果非常相似，至少65％的颗粒其直径(或颗粒大小)介于1-6微米之间。

从该粉末起始按照实施例2描述的很相似的程序制备了pH5.0、浓度10mg/ml的EPI-hNE-4悬液。通过比色法分析人中性粒细胞弹性蛋白酶抑制试验确定了此悬液的生物活性，如以上实施例4所述。测得的生物活性与实施例5对pH5.0、EPI-hNE-4浓度10mg/ml的悬液测得的结果无显著差别。

实施例8

干粉的制备及其激光颗粒度分析

用生产前几批EPI-hNE-4得到的2升悬液制备了干粉。

10000g离心此悬液30分钟。弃上清液，将留下的沉淀物均匀分散于100毫升的10mM碳酸氢铵缓冲液中。在0.22微米过滤器上过滤此悬液。回收过滤器，在装有蓝色硅胶的干燥器内(可使水份逐渐挥发的系统)干燥过夜。从过滤器上回收到一个4克重的易碎粉块。用巴黎Moderne实验室的电动研磨装置Moulin JK进行均化处理，从而产生一种表观均匀的极细粉末。，

用Malvern装置(Malvern Mastersizer 2000<Malvern，UK>，配备有一个Scirocco 2000型的干式采样器)对该粉末作颗粒度分析。

结果显示，大部分(80％以上)颗粒的直径(或颗粒大小)介于1-6微米之间，至少60％的颗粒直径(或颗粒大小)介于1-3微米之间。直径(或颗粒大小)的中值约为2.66微米。

实施例9

喷雾干燥法制备干粉及其激光颗粒度分析和生物活性试验

将1克粉末状或结晶形式的EPI-hNE-4(见例8)溶解于含有1％盐酸的pH2.5的水中。将该溶液用一台微型喷雾干燥器Buchi B191作喷雾干燥(喷成雾状)，操作条件如下：

■喷雾器内径：0.7mm

■喷雾流速：3.4g/l

■空气压力：600l/h

■干空气流速：35m³/h

■干空气进气温度：120℃

■干空气出气温度：74-75℃

把粉末放在Thomas平板上作直接显微镜观察。图3B是粉末的显微图像，显示干燥形式EPI-hNE-4的不规则球形结构，其中大部分单个颗粒的直径或颗粒大小在1-3微米之间。与图3A相比没有暗区出现，说明该粉末均一性良好。

用配备有一个Scirocco 2000型干式采样器的Malvern Multisizer 2000对该粉末作颗粒大小分布的激光颗粒度分析。

结果显示，90％的颗粒直径或颗粒大小为0.5-4.0微米，75％的颗粒直径或颗粒大小为0.5-2.8微米，60％的颗粒其直径或颗粒大小为.5-2.2微米，MMAD值为2.16微米。

如实施例4所述测得的粉末生物比活性显示，此蛋白质具有完全活性。