针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂及其应用

摘要

本发明涉及针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂及其应用，具体是涉及针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂在用于制备福氏志贺菌血清型检测剂中的应用；所述的检测剂用于检测福氏志贺菌血清型，或者用于检测包含福氏志贺菌的鉴别诊断用样品。本发明还涉及福氏志贺菌MASF IV-1表型检测用制剂，其包括针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的引物对SEQ ID No.2与SEQ ID No.3，还涉及利用所述的引物对检测福氏志贺菌MASF IV-1表型的方法，以及区分福氏志贺菌Xv血清型与X血清型、区分4a与4av血清型以及区分Y与Yv血清型的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术检测福氏志贺菌血清型的领域，具体涉及针对福氏志贺菌质粒 携带基因lpt-O(LPS phosphoethenolamine transferase for O-antigen，O抗脂多糖磷酸乙 醇胺转移酶)的检测试剂及其应用，特别涉及针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检 测用引物及其用于鉴定福氏志贺菌MASF IV-1表型。

背景技术

福氏志贺菌(Shigella flexneri)是发展中国家细菌性痢疾的主要病原菌，据估计每年导 致大约100多万人感染，引起许多人死亡，其中大多数是5岁以下的儿童(Kotloff et al.， 1999)。

充分的证据表明，人体对痢疾感染的免疫是血清型特异的(Phalipon et al.，1995)。根 据菌体表面脂多糖(LPS)O抗原的差异，福氏志贺菌进一步分为许多血清型，目前， 共有16个血清型已经确认(Simmons&Romanowska，1987；Stagg et al.，2009；Sun et al.， 2011；Ye et al.，2010)。福氏志贺菌除6型(F6)外，其它血清型的O抗原都具有由四糖 重复单位构成的多糖骨架：→3)-β-DGlcNac-(1→2)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)- α-L-Rha-(1→(Simmons&Romanowska，1987)。其中Y血清型具有基本的骨架，在骨架 的不同糖基上添加糖基和/或乙酰基导致型(如I，II，III，IV，V，IC)和群(如3，4；6；7，8)特异 抗原的出现(Stagg et al.，2009)。乙酰化修饰只发生在第三个鼠李糖基，导致群抗原6 或型抗原决定因子在血清型3a、3b、1b和4b菌株中出现(Clark et al.，1991；Verma et al.， 1991)。糖基化修饰可以发生在任何糖基上。负责型抗原I，IC，II，IV，V和群抗原7，8的 基因已经确认(Adams et al.，2001；Adhikari et al.，1999；Guan et al.，1999；Mavris et al.， 1997；Stagg et al.，2009)，它们以基因簇的形式存在：gtrA、gtrB和gtr(型)(Allison&Verma， 2000)；其中gtrA和gtrB是高度保守的，在不同噬菌体间可以互换；而第三个基因gtr(型) 是噬菌体特异的，编码糖基转移酶，负责催化在四糖骨架上添加葡萄糖基(Allison& Verma，2000；Stagg et al.，2009)。到目前为止，所有的O抗修饰基因被认为是由7种血 清型转换噬菌体(SfI，SfIC，SfII，Sf6，SfIV，SfV，SfX)携带，他们的基因组整合到宿主菌基 因组的保守位点(Allison et al.，2002；Casjens et al.，2004；Clark et al.，1991；Guan et al.， 1999；Mavris et al.，1997)。

血清型是目前福氏志贺菌研究的主要内容，对于痢疾感染的治疗、预防、流行控制 及疫苗研制等方面具有重要的意义。最近，几种新血清型被不断报道。其中某些已经成 为优势血清型(Talukder et al.，2003)。2001年，在中国河南出现一种新的血清型Xv，在 随后的几年内(2002-2006)，它取代2a成为河南省优势血清型，分别占分离福氏志贺菌 的14％，35％，47％，48％，和27％(Ye et al.，2010)。Xv血清型也在山两出现，分别占67％ (2006)和33％(2007)。在甘肃、安徽和上海2007年的分离率分别是67％、54％和35％ (Ye et al.，2010)。

血清型Xv能够与单克隆抗体MASFIV-1和群7，8抗血清凝集(Ye et al.，2010)，因此 他最初被称为4c或4x(Carlin&Lindberg，1987；Pryamukhina&Khomenko，1988)。相对 于X血清型，Xv血清型菌株在他的LPS上含有MASF IV-1(或称为E1037)抗原位点， 这种抗原位点也在福氏志贺的其它血清型(4a，Y和6)菌株中发现(Carlin，N.I.，and A.A.Lindberg.1987.Monoclonal antibodies specific for Shigella flexneri  lipopolysaccharides：clones binding to type IV，V，and VI antigens，group 3，4antigen，and an  epitope common to all Shigella flexneri and Shigella dysenteriae type 1 stains.Infect Immun 55：1412-1420；Carlin，N.I.，M.Rahman，D.A.Sack，A.Zaman，B.Kay，and A.A. Lindberg.1989.Use of monoclonal antibodies to type Shigella flexneri in Bangladesh.J Clin  Microbiol 27：1163-1166)。目前，群抗原7，8的决定因子已经明确，它存在于SfX噬菌体 基因组上，整合在宿主菌基因组中(Ye et al.，2010)。但是，MASF IV-1抗原决定因子目 前还没有被发现。寻找福氏志贺菌血清型的分子标识，发展基于PCR等分子生物学技 术的鉴定方法，对于及时、准确鉴定病原菌血清型具有重要意义。

发明内容

本发明的首要目的在于寻找福氏志贺菌MASF IV-1抗原决定因子或者区分血清型 Xv与X的分子标识，发展分子生物学技术鉴定福氏志贺菌血清型的方法。

本发明的进一步目的在于提供针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂在用 于制备福氏志贺菌血清型检测剂中的应用。

本发明的其他目的在于提供福氏志贺菌MASF IV-1表型检测用制剂，检测福氏志贺 菌MASF IV-1表型的方法，以及区分福氏志贺菌Xv血清型与X血清型的方法。

本案发明人经过研究发现，一个质粒携带的基因lpt-O(其在基因库中的登记号为 SFxv_5135，具体序列见SEQ ID No.1)介导了在福氏志贺菌O抗上添加PEtN基团导致 了MASF IV-1表型的出现，并经实验验证了lpt-O基因是鉴别福氏志贺菌Xv血清型和 X血清型的一个分子标识，且lpt-O基因不但是Xv血清型MASF IV-1表型所必需的， 也是其它MASF IV-1+表型菌株所必需的。

据此，本发明提供了一种区分福氏志贺菌血清型Xv与X的分子标识，或者检测福 氏志贺菌MASF IV-1表型的分子标识：lpt-O基因。该lpt-O基因同时也可作为区分福氏 志贺菌4av血清型与4a血清型、或者区分福氏志贺菌Yv血清型与Y血清型的分子标识。

在此基础上，一方面，本发明提供了针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试 剂在用于制备福氏志贺菌血清型检测剂中的应用；所述的检测剂用于检测福氏志贺菌血 清型，或者用于检测包含福氏志贺菌的的鉴别诊断用样品。

根据本发明的具体实施方案，上述针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂在 用于制备福氏志贺菌血清型检测剂中的应用中，所述检测剂是用于检测福氏志贺菌 MASF IV-1表型。如检测到所测样品中福氏志贺菌lpt-O基因的存在，则可表明福氏志贺 菌MASF IV-1阳性。

根据本发明的优选具体实施方案，本发明中，所述针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O 的检测试剂是采用生物技术例如PCR方法检测待测样品中lpt-O基因存在与否的试剂。 更具体地，其包括本发明为检测lpt-O基因而专门设计的以下特异性引物：

SEQ ID No.2：ATCTAGTATTGTTGGCGTTA；以及

SEQ ID No.3：CCTTTTCTTGTGTTCTTATC。

另一方面，本发明还提供了一种福氏志贺菌MASF IV-1表型检测用制剂，其主要基 于本发明的发现——lpt-O基因介导了在福氏志贺菌O抗上添加PEtN基团而导致MASF IV-1表型出现而提供的，具体地，该福氏志贺菌MASF IV-1表型检测用制剂为针对福氏 志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂。

根据本发明的具体实施方案，本发明的福氏志贺菌MASF IV-1表型检测用制剂，其 包括本发明为检测lpt-O基因而专门设计的以下引物：SEQ ID No.2；以及SEQ ID No.3。

另一方面，本发明还提供了一种福氏志贺菌MASF IV-1表型检测用试剂盒，该试剂 盒包含引物对SEQ ID No.2与SEQ ID No.3。

另一方面，本发明还提供了一种检测福氏志贺菌MASF IV-1表型的方法，该方法包 括利用引物对SEQ ID No.2与SEQ ID No.3进行扩增。如扩增结果阳性，则表明所测样 品中福氏志贺菌MASF IV-1+表型。

另一方面，本发明还提供了一种区分福氏志贺菌Xv血清型与X血清型的方法，该方 法包括利用引物对SEQ ID No.2与SEQ ID No.3进行扩增。如扩增结果阳性，则表明所 测福氏志贺菌Xv血清型而非X血清型。

另一方面，本发明还提供了一种区分福氏志贺菌4av血清型与4a血清型的方法，该 方法包括利用引物对SEQ ID No.2与SEQ ID No.3进行扩增。如扩增结果阳性，则表明 所测福氏志贺菌4av血清型而非4a血清型。

另一方面，本发明还提供了一种区分福氏志贺菌Yv血清型与Y血清型的方法，该方 法包括利用引物对SEQ ID No.2与SEQ ID No.3进行扩增。如扩增结果阳性，则表明所 测福氏志贺菌Yv血清型而非Y血清型。

根据本发明的具体实施方案，本发明的检测福氏志贺菌MASF IV-1表型的方法，或 是区分福氏志贺菌Xv血清型与X血清型、区分福氏志贺菌4av血清型与4a血清型、或 者区分福氏志贺菌Yv血清型与Y血清型的方法中，所述扩增是基于引物与模板的特异 结合产生特异扩增产物的酶促核酸体外扩增检测技术；具体地，所述扩增可选自：聚合 酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应、链置换扩增、核酸单碱基取代、转录介导扩增。 在本发明中，更优选PCR反应。在PCR中，PCR系统是由耐热DNA聚合酶、引物、 脱氧核苷酸、待扩增的DNA模板和缓冲液组成。本发明在选择优选引物的基础上，还 对反应体系和条件进行了优化。优选的PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性 30s，55℃退火50s，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸5min。

根据本发明的具体实施方案，本发明的检测福氏志贺菌MASF IV-1表型的方法，或 是区分福氏志贺菌Xv血清型与X血清型、区分福氏志贺菌4av血清型与4a血清型、或 者区分福氏志贺菌Yv血清型与Y血清型的方法，可进一步包括在所述扩增之后进行定 性分析。定性分析方法可以是本领域普通技术人员已知的，例如包括利用凝胶电泳显示 所述扩增产物，本领域技术人员可根据扩增产物的大小，确定所用的凝胶和浓度。

根据本发明的具体实施方案，本发明中所述检测剂(检测用制剂)优选用于对分离 的福氏志贺菌菌株进行检测。具体地，所述的检测剂可以是试剂盒。所述检测剂可用于 检测福氏志贺菌或包含福氏志贺菌的鉴别诊断用样品。本发明所设计的引物具有较高的 特异性，可应用于离体病人样品(例如排泄物、肠积液、呕吐物等)、可能混有福氏志贺 菌的水样、土壤、食品、化妆品等样品的检测，这些样品可以经过或不经过任何富集。

根据本发明的更具体实施方案，本发明的检测福氏志贺菌MASF IV-1表型的方法， 或是区分福氏志贺菌Xv血清型与X血清型、区分福氏志贺菌4av血清型与4a血清型、 或者区分福氏志贺菌Yv血清型与Y血清型的方法包括：

从待测样品中提取模板DNA；

以所提取DNA为模板，利用引物对SEQ ID No.2与SEQ ID No.3进行扩增；

对扩增结果进行定性分析。

利用本发明的方法，所述引物具有较高的特异性，鉴定时只需要菌株或样品的DNA 作为模板，不需要分离单菌落，根据扩增结果，可快速检测待测样品中lpt-O基因存在 与否，从而进一步鉴别福氏志贺菌血清型(主要是用于鉴别福氏志贺菌MASF IV-1表型， 或是鉴别福氏志贺菌为Xv血清型或X血清型、或者鉴别福氏志贺菌为4av血清型或4a 血清型、或者鉴别福氏志贺菌为Yv血清型或Y血清型)。而且本发明的结果判定简易、 客观，避免了传统血清免疫凝集反应中的主观性、不稳定性等问题。

为验证本发明上述技术方案的可实施性，在本发明的一具体实施例(实施例1)中， 证明了克隆的lpt-O基因能够转换X血清型福氏志贺菌菌株51580成为血清型Xv，而 且转换菌株的LPS谱与福氏志贺菌Xv血清型菌株2002017完全相同，进一步证明了 lpt-O基因负责PEtN残基的添加，也是MASF IV-1抗原的决定因子。在该实施例中， 还对其他MASF IV-1阳性表型的临床分离株Yv和4av等进行质粒图谱分析和杂交实验 证实，这些菌株都含有与福氏志贺菌Xv血清型菌株2002017相同的质粒和lpt-O基因， 进一步表明lpt-O基因不但是Xv血清型MASF IV-1表型所必需的，也是其它MASF IV-1+表型菌株所必需的。在本发明的另一具体实施例(实施例2)中，用所设计的引物 对SEQ ID No.2与SEQ ID No.3对10株Xv血清型和5株X血清型福氏志贺菌菌株进行 了检测，经多次反复检测，结果均显示只有Xv血清型菌株中检测到扩增产物的存在， 而在5株X血清型菌株中没有发现。在本发明的另一具体实施例(实施例3)中，对 MASF IV-1阳性表型的临床分离株Yv和4av进行了扩增检测，扩增结果阳性。

为了进一步评价本发明所述引物PCR扩增特异性，本发明还在一具体实施例(实 施例4)中检测了一些非福氏志贺菌菌株，包括痢疾志贺(血清型1-12)、鲍氏志贺(血 清型1-18)、宋内志贺(S)、宋内志贺(R)、EHEC(EDL933)，大肠杆菌(HB101)、大肠 杆菌K12(MG1655)、单增李斯特菌(54003)等，这些菌扩增均为阴性，证明本发明的 方法的特异性。

综上所述，本发明发现了福氏志贺菌MASF IV-1抗原决定因子：lpt-O基因，在此 基础上提供了针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂在用于制备福氏志贺菌血 清型检测剂中的应用，还提供了福氏志贺菌MASF IV-1表型检测用制剂、检测福氏志贺 菌MASF IV-1表型的方法，本发明的技术对于及时、准确鉴定病原菌血清型具有重要意 义。

附图说明

图1显示福氏志贺菌X(a)，Xv(b)和lpt-O基因转化株51580-Xv(c)的O抗结构的 ¹³C NMR图谱。数字显示糖基上的质子数G，Glc；GN，GlcNAc；RI，Rha^I；RII，Rha^II；RIII， Rha^III。

图2显示福氏志贺菌血清型X(A)，Xv(B)，Yv(C)和4av(D)的O抗结构。

图3显示PCR检测血清型Xv和X菌株中lpt-O基因的扩增结果。其中，泳道1： 血清型Xv菌株2002017作为对照；泳道2-5、11-15：血清型Xv菌株；泳道6-10：血 清型X菌株。

图4显示lpt-O基因介导的血清型转化。图片A，使用MASFIV-1单克隆抗体 (Reagensia AB)和单价抗体IV(Denka Seiken)鉴定转化子的血清型。图片B，脂多糖(LPS) 谱分析转化子；脂多糖在15％胶上进行TSDS-PAGE电泳，银染后判断结果；箭头指示 不同血清型(Xv和X)LPS谱差异的位置。

图5显示质粒pSFxv_2的基因组结构及在Xv and X血清型菌株中的存在情况。图 片A，质粒pSFxv_2的基因组结构，粗箭头显示ORFs，编码蛋白根据基因库中的基因 组注释(accession No.CP001385)，特殊的lpt-O基因以红色标识，扩增用引物以细箭头 显示。图片B，不同血清型中质粒谱；2002017的质粒(1道)作为阳性对照；HindIII酶 切的Lambda DNA(TaKaRa，Japan)作为marker。图片C，lpt-O基因的Southern杂交检 测，从2002017扩增得到的lpt-O基因作为探针；血清型Xv(1-5道)，血清型X菌株(6-10 道)。

图6显示杂交分析lpt-O基因在4av和Yv血清型菌株中的分布结果，其中，泳道1： 菌株2002017，泳道2：X血清型菌株；泳道3-5：4av菌株；泳道6-21为Yv菌株。

图7显示18株Yv，19株Xv，21株X和2株Y lpt-O基因PCR扩增结果。其中4 株PCR扩增阳性的X分别为HN059，HN060，HN066和HN378。

图8显示不同血清型菌株的lpt-O基因PCR扩增结果。

图9显示PCR扩增特异性检测结果。第一排的2-14分别是鲍氏志贺菌血清型 B1-B13；第二排的2-6分别是B14、B15、B16、B17、B18，7-14分别是痢疾志贺血清 型D1-D8；第三排2-12分别是D9、D10、D11、D12、宋内志贺SS和SR型、大肠杆 菌K12(MG1655)、嗜水气单胞菌、单增李斯特菌(54003)、大肠杆菌K12(HB101)、 UPEC(CFT073)、EHEC(EDL933)。各排1道为阳性对照菌株2002017。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅 用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域 熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。

菌株来源：

下列实施例中所用福氏志贺菌菌株中，菌株NCTC 9726(4b)，NCTC 9725 (4a)，NCTC 8296(4av)，NCTC5(1b)，NCTC4(2b)，NCTC8521(4a)，NCTC7885(4a)， NCTC8522(4b)，NCTC8598(4b)，NCTC8336(4b)，NCTC8523(5a)，NCTC9728 (5a)，NCTC8524(5a)购自英国标准菌株国家保藏中心(National Collection of Type  Cultures，NCTC)。菌株51577(4b)，51580(Y)，51247(5a)购自中国生物制品药品 检定所；

菌株2002017为2002年在中国河南分离，中国疾病预防控制中心传染病预防控制 所微生物室收藏保存；

检测分析的福氏志贺菌为1997～2011年间在中国临床分离株，中国疾病预防控制 中心传染病预防控制所微生物室保存；

用于特异性分析的菌株为商购标准菌株，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 微生物室收藏保存；

主要试剂及材料：

Tag DNA聚合酶、PfuDNA聚合酶购自TaKaLa公司；

DNA回收纯化试剂盒为QIGEN公司产品；

染色体DNA提取试剂盒购自上海生工公司；

福氏志贺菌群抗原和型抗原单价抗血清购自日本生研公司；

福氏志贺菌群抗原和型抗原单克隆抗体购自瑞典Reagensia AB公司；

LPS提取试剂盒为LPS Extraction Kit(Intron，USA)；

质粒提取试剂盒为plasmid purification kit(Qiagen，Germany)；

核酸杂交和检测试剂盒为ECLTM Direct Nucleic Aicd Labelling and Detection System (Amersham)；

DNA分子量标准(DL2000)(100～2,000)为宝生物工程有限公司产品；

其它试剂均为分析纯。

实施例1、lpt-O基因特异性检测引物的设计

本实施例中，采用二维(two-dimensional)¹H，¹H和¹H，¹³C NMR技术(Duus et al.， 2000)，对Xv血清型菌株2002017的LPS结构进行了解析，它的¹H NMR和¹³C NMR谱 见图1中b，其具有典型的X血清型O抗结构(Kenne et al.，1977)(图2中B)，另外， 在Xv菌株的NMR谱中发现一个PEtN基团的信号(表1)，该PEtN基团添加在RhaII(图 2中B)，而且这是与X血清型(图2中A)的唯一区别。考虑到两者之间的血清型差 异，可以判断PEtN修饰是MASF IV-1+表型出现的原因。

表1  ¹H and¹³C NMR化学位移s(δ，ppm)

本发明中，进一步通过基因组比较，在菌株2002017的一个质粒中(pSFxv_2， accession No.CP001385)，发现一个基因SFxv_5135与PEtN转移酶蛋白 Lpt3(N.meningitides)，LptA(N.meningitides)，Lpt6(N.meningitides)，CptA(S.Typhimurium)， PmrC(S.Typhimurium)和EptB(E.coli)(Reynolds，C.M.，S.R.Kalb，R.J.Cotter，and C.R.Raetz.2005.A phosphoethanolamine transferase specific for the outer 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid residue of Escherichia coli lipopolysaccharide. Identification of the eptB gene and Ca2+hypersensitivity of an eptB deletion mutant.J Biol  Chem 280：21202-21211；Tamayo，R.，B.Choudhury，A.Septer，M.Merighi，R.Carlson， and J.S.Gunn.2005.Identification of cptA，a PmrA-regulated locus required for  phosphoethanolamine modification of the Salnonella enterica serovar typhimurium  lipopolysaccharide core.J Bacteriol 187：3391-3399；Wenzel，C.Q.，F.St Michael，J.Stupak， J.Li，A.D.Cox，and J.C.Richards.2009.Functional characterization of Lpt3 and Lpt6，the  inner-core lipooligosaccharide phosphoethanolamine transferases from Neisseria meningitidis. J Bacteriol 192：208-216)有一定的同源性(22-99％一致性，39-99％相似性)。此种蛋白负责 在LPS或LOS上添加PEtN基团。而且SFxv_5135只是出现在Xv血清型测序菌株 2002017基因组中，而在其它测序的MASFI V-1-福氏志贺菌sf301、2457t和8401中没 有被发现，提示这个基因可能与Xv血清型菌株中的PEtN修饰有关。

本实施例中，还克隆了lpt-O基因的全序列(1521bp，参见SEQ ID No.1)和其上 下游的533bp片段(上游252bp，下游281bp，包含可能的启动子和终止子序列)到 pMD20T(TaKaRa，Japan)构建质粒pSQZ，转化到X血清型菌株51580中，其转化子 51580-Xv血清型为Xv；其血清型特征与野生Xv血清型菌株2002017完全一致(图4中 A)。LPS谱分析发现，转化子51580-Xv的LPS谱与2002017的完全相同(图4中B)。1H，1H 和¹H，¹³C NMR分析转化子51580-Xv发现，转化子具有与野生Xv血清型菌株2002017 一样的谱(图1中c)。本实施例中进一步将pSQZ转化到4a血清型菌株NCTC9725中， 转化子9725-4av能够与MASF IV-1发生凝集，血清型与现有技术中报道的4a血清型菌 株G1668(在Rha^II结合了PEtN基团，图2中D)完全一致(图4中A)(Perepelov，A.V.， L.L′Vov V，B.Liu，S.N.Senchenkova，M.E.Shekht，A.S.Shashkov，L.Feng，P.G. Aparin，L.Wang，and Y.A.Knirel.2009.A new ethanolamine phosphate-containing variant  of the O-antigen of Shigella flexneri type 4a.Carbohydr Res 344：1588-1591)(关于现有技术 中报道的4a血清型菌株G1668，为非典型性4a血清型菌株，其与其他典型性4a血清 型菌株的差异在于能够与MASF IV-1发生凝集，本发明中将该菌株G1668的血清型鉴 定为4av)。模块分析发现SFxv_5135基因编码蛋白的羧基端含有一个硫酯酶(sulfatase) 功能域。而已知的具有PEtN转移酶活性的蛋白中(Lpt3，Lpt6，LptA，CptA，EptC，EptB， PmrC，Hp0022)(Cullen，T.W.，J.A.Madsen，P.L.Ivanov，J.S.Brodbelt，and M.S.Trent. 2011.Characterization of unique modification of flagellar rod protein FlgG by Campylobacter  jejuni lipid A phosphoethanolamine transferase，linking  bacterial locomotion and  antimicrobial peptide resistance.J Biol Chem 287：3326-3336；Kanipes，M.I.，S.Lin，R.J. Cotter，and C.R.Raetz.2001.Ca2+-induced phosphoethanolamine transfer to the outer 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid moiety of Escherichia coli lipopolysaccharide.A novel  membrane enzyme dependent upon phosphatidylethanolamine.J Biol Chem 276：1156-1163； Mackinnon，F.G.，A.D.Cox，J.S.Plested，C.M.Tang，K.Makepeace，P.A.Coull，J.C. Wright，R.Chalmers，D.W.Hood，J.C.Richards，and E.R.Moxon.2002.Identification  of a gene(lpt-3)required for the addition of phosphoethanolamine to the lipopolysaccharide  inner core of Neisseria meningitidis and its role in mediating susceptibility to bactericidal  killing and opsonophagocytosis.Mol Microbiol 43：93l-943；Reynolds，C.M.，S.R.Kalb，R. J.Cotter，and C.R.Raetz.2005.A phosphoethanolamine transferase specific for the outer 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid residue of Escherichia coli lipopolysaccharide. Identification of the eptB gene and Ca2+hypersensitivity of an eptB deletion mutant.J Biol  Chem 280：21202-21211；Tamayo，R.，B.Choudhury，A.Septer，M.Merighi，R.Carlson， and J.S.Gunn.2005.Identification of cptA，a PmrA-regulated locus required for  phosphoethanolamine modification of the Salnonella enterica serovar typhimurium  lipopolysaccharide core.J Bacteriol 187：3391-3399；Tran，A.X.，M.J.Karbarz，X.Wang， C.R.Raetz，S.C.McGrath，R.J.Cotter，and M.S.Trent.2004.Periplasmic cleavage and  modification of the 1-phosphate group of Helicobacter pylori lipid A.J Biol Chem 279：55780-55791；Wenzel，C.Q.，F.St Michael，J.Stupak，J.Li，A.D.Cox，and J.C. Richards.2009.Functional characterization of Lpt3 and Lpt6，the inner-core  lipooligosaccharide phosphoethanolamine transferases from Neisseria meningitidis.J Bacteriol 192：208-216；Wright，J.C.，D.W.Hood，G.A.Randle，K.Makepeace，A.D.Cox， J.Li，R.Chalmers，J.C.Richards，and E.R.Moxon.2004.lpt6，a gene required for  addition of phosphoethanolamine to inner-core lipopolysaccharide of Neisseria meningitidis  and Haemophilus influenzae.J Bacteriol 186：6970-6982)，均含有硫酯酶功能域，因此， SFxv_5135基因编码蛋白可能具有PEtN转移酶活性，因此，本发明中将其命名为 lpt-O(LPS phosphoethenolamine transferase for O-antigen)。

质粒图谱分析发现，同标准菌株2002017一样，所有的Xv都含有一个特殊的 pSFxv_2样的质粒(图5中A)，而杂交显示lpt-O基因都在这个质粒上(图5中B)。

以前的研究证实血清型4av菌株G1668在O抗的RhaIII位置含有一个PEtN基团 (Perepelov，A.V.，L.L′Vov V，B.Liu，S.N.Senchenkova，M.E.Shekht，A.S.Shashkov， L.Feng，P.G.Aparin，L.Wang，and Y.A.Knirel.2009.A new ethanolamine  phosphate-containing variant of the O-antigen of Shigella flexneri type 4a.Carbohydr Res 344：1588-1591.)。本发明对一株Yv菌株(MASF IV-1+)O抗结构分析发现，在O抗的 Rha^III位置同样含有一个PEtN基团(图2中C)。本发明还进一步对其他MASF IV-1+ 表型的临床分离株如Yv和4av等的质粒图谱和杂交分析发现，这些菌株都含有这样的 质粒和基因(图6)，证实lpt-O基因不但是Xv血清型MASF IV-1表型所必需的，也是 其它MASF IV-1+表型菌株所必需的。

针对lpt-O基因，本发明设计了特异性的检测用引物对lpt-O-2：

lpt-O-2U(SEQ ID No.2)：ATCTAGTATTGTTGGCGTTA(nt 1721-1740， complementary to pSFxv-2序列)

lpt-O-2L(SEQ ID No.3)：CCTTTTCTTGTGTTCTTATC(nt 2799-2818)。

实施例2、PCR扩增检测鉴别Xv与X血清型菌株

本实施例中，用所设计的引物对lpt-O-2检测了10株福氏志贺菌Xv血清型菌株和 5株X血清型菌株。

PCR扩增：

引物对委托Sangon Biotech(Shanghai)合成。PCR扩增采用TaKaRa公司的PCR扩 增试剂盒(KakaRa，Japan)。每个PCR反应混合物包含：1×PCR缓冲液，0.2μM of引物， 3μl of模板DNA，2.5U DNA聚合酶和0.4mM dNTP，总量50μl。PCR扩增利用PCR 仪SensoQuest LabCycler(Germany)进行，具体条件：94℃预变性5min；94℃变性30s， 55℃退火50s，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸5min。

扩增产物经电泳，结果参见图3，其中，泳道1：血清型Xv菌株2002017作为对照； 泳道2-5、11-15：血清型Xv菌株；泳道6-10：血清型X菌株。结果显示，只有Xv菌 株中检测到相应的扩增产物，而在5个X血清型菌株中没有发现。

实施例3、PCR扩增检测MASF IV-1表型

本实施例中，按照实施例2记载的扩增方法，对表2中所列333株包含15个血清 型菌株进行PCR扩增检测，结果只在MASF IV-1阳性菌株(26Xv，1株4av和25株 Yv)和4株X、1株4b中出现，经测序证实，在这4株X和1株4b中的lpt-O基因发 生单个碱基缺失突变(表2)(图7，图8)。

表2lpt-O基因在福氏志贺菌中的携带情况

¹+和-/+指示lpt-O基因存在情况.阳性菌株数显示在括号内。

²4av血清型菌株(2002091和NCTC 8296)与4a血清型菌株差异在MASF IV-1凝集。

³Yv血清型菌株与Y血清型菌株的血清型差异在于MASF IV-1和单价抗血清IV凝集。

实施例4、特异性检测

为检测本发明所述引物PCR扩增特异性，本实施例中，分别提取菌株 S.dysenteriae(1-18)、S.boydii(1-12)、S.Sonnie(S)、S.Sonnie(R)、EHEC(EDL933)，大肠杆 菌K12(HB101)、大肠杆菌K12(MG1655)、UPEC(CFT073)、单增李斯特菌(54003)、 嗜水气单胞菌(表3)的DNA模板，按照实施例2记载的方法，进行PCR扩增，结果 参见图9，图中，第一排的2-14分别是鲍氏志贺菌血清型B1-B13；第二排的2-6分别 是B14、B15、B16、B17、B18，7-14分别是痢疾志贺血清型D1-D8；第三排2-12分别 是D9、D10、D11、D12、宋内志贺SS和SR型、大肠杆菌K12(MG1655)、嗜水气单胞 菌、单增李斯特菌(54003)、大肠杆菌K12(HB101)、UPEC(CFT073)、EHEC(EDL933)； 各排1道为阳性对照菌株2002017。从图中可以看出，表3中所列各菌株均没有扩增到 阳性片段。

表3用于特异性分析的菌株及PCR扩增结果

  菌株/血清型   菌株数  特异基因PCR反应结果   S.Sonnie(S)   1  -   S.Sonnie(R)   1  -   S.dysenteriae(1-18)   各1  -   S.boydii(1-12)   各1  -   EHEC(EDL933)   1  -   UPEC(CFT073)   1  -   大肠杆菌K12(HB101)   1  -   大肠杆菌K12(MG1655)   1  -   单增李斯特菌(54003)   1  -   嗜水气单胞菌   1  -

参考文献：

1.Adams，M.M.，Allison，G.E.&Verma，N.K.(2001).Type IV O antigen modification  genes in the genome of Shigella flexneri NCTC 8296.Microbiology 147，851-860.

2.Adhikari，P.，Allison，G.，Whittle，B.&Verma，N.K.(1999).Serotype 1a O-antigen  modification：molecular characterization of the genes involved and their novel  organization in the Shigella flexneri chromosome.J Bacteriol 181，4711-4718.

3.Allison，G.E.&Verma，N.K.(2000).Serotype-converting bacteriophages and  O-antigen modification in Shigella flexneri.Trends Microbiol 8，17-23.

4.Allison，G.E.，Angeles，D.，Tran-Dinh，N.&Verma，N.K.(2002).Complete genomic  sequence of SfV，a serotype-converting temperate bacteriophage of Shigella flexneri.J Bacteriol 184，1974-1987.

5.Carlin，N.I.&Lindberg，A.A.(1987).Monoclonal antibodies specific for Shigella  flexneri lipopolysaccharides：clones binding to type IV，V，and VI antigens，group 3，4 antigen，and an epitope common to all Shigella flexneri and Shigella dysenteriae type 1 stains.Infect Immun 55，1412-1420.

6.Casjens，S.，Winn-Stapley，D.A.，Gilcrease，E.B.，Morona，R.，Kuhlewein，C.，Chua， J.E.，Manning，P.A.，Inwood，W.&Clark，A.J.(2004).The chromosome of Shigella  flexneri bacteriophage Sf6：complete hucleotide sequence，genetic mosaicism，and DNA  packaging.J Mol Biol 339，379-394.

7.Clark，C.A.，Beltrame，J.&Manning，P.A.(1991).The oac gene encoding a lipopolysaccharide O-antigen acetylase maps a djacent to the integrase-encoding gene on  the genome of Shigella flexneri bacteriophage Sf6.Gene 107，43-52.

8.Cullen，T.W.，Madsen，J.A.，Ivanov，P.L.，Brodbelt，J.S.&Trent，M.S.(2011). Characterization of unique modification of flagellar rod protein FlgG by Campylobacter  jejuni lipid A phosphoethanolamine transferase，linking bacterial locomotion and  antimicrobial peptide resistance.J Biol Chem 287，3326-3336.

9.Duus，J.，Gotfredsen，C.H.&Bock，K.(2000).Carbohydrate structural determination  by NMR spectroscopy：modern methods and limitations.Chem Rev 100，4589-4614.

10.Guan，S.，Bastin，D.A.&Verma，N.K.(1999).Functional analysis of the O antigen  glucosylation gene cluster of Shigella flexneri bacteriophage SfX.Microbiology 145 1263-1273.

11.Hanniffy，O.M.，Shashkov，A.S.，Senchenkova，S.N.，Tomshich，S.V.，Komandrova， N.A.，Romanenko，L.A.，Knirel，Y.A.&Savage，A.V.(1998).Structure of a highly  acidic O-specific polysaccharide of lipopolysaccharide of Pseudoalteromonas  haloplanktis KMM 223(44-1)containing L-iduronic acid and D-QuiNHb4NHb. Carbohydr Res 307，291-298.

12.Jansson P-E，Kenne L&T，W.(1987).A 2D-1H-n.m.r.study of some Shigella flexneri O-polysaccharides.Carbohydr Res 166，12.

13.Jansson P-E，Kenne L&T，W.(1988).A 13C-n.m.r.study of some Shigella flexneri O-polysaccharides.Carbohydr Res 179，359.

14.Kanipes，M.I.，Lin，S.，Cotter，R.J.&Raetz，C.R.(2001).Ca2+-induced  phosphoethanolamine transfer to the outer 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid moiety of  Escherichia coli lipopolysaccharide.A novel membrane enzyme dependent upon  phosphatidylethanolamine.J Biol Chem 276，1156-1163.

15.Kenne，L.，Lindberg，B.，Petersson，K.，Katzenellenbogen，E.&Romanowska，E. (1977).Structural studies of the Shigella flexneri variant X，type 5a and type 5b O-antigens.Eur J Biochem 76，327-330.

16.Kenne，L.，Lindberg，B.，Petersson，K.，Katzenellenbogen，E.&Romanowska，E. (1978).Structural studies of Shigella flexneri O-antigens.Eur J Biochem 91，279-284.

17.Kotloff，K.L.，Winickoff，J.P.，Ivanoff，B.，Clemens，J.D.，Swerdlow，D.L.， Sansonetti，P.J.，Adak，G.K.&Levine，M.M.(1999).Global burden of Shigella  infections：implicatiohs for vaccine development and implementation of control strategies. Bull World Health Organ 77，651-666.

18.Mackinnon，F. G.，Cox，A.D.，Plested，J.S.&other authors(2002).Identification of a gene(lpt-3)required for the addition of phosphoethanolamine to the lipopolysaccharide  inner core of Neisseria meningitidis and its role in mediating susceptibility to bactericidal  killing and opsonophagocytosis.Mol Microbiol 43，931-943.

19.Mavris，M.，Manning，P.A.&Morona，R.(1997).Mechanism of bacteriophage  SfII-mediated serotype conversion in Shigella flexneri.Mol Microbiol 26，939-950.

20.Perepelov，A.V.，L′Vov V，L.，Liu，B.&other authors(2009).A new ethanolamine  phosphate-containing variant of the O-antigen of Shigella flexneri type 4a.Carbohydr  Res 344，1588-1591.

21.Phalipon，A.，Kaufmann，M.，Michetti，P.，Cavaillon，J.M.，Huerre，M.，Sansonetti，P. &Kraehebuhl，J.P.(1995).Monoclonalimmunoglobulin A antibody directed against  serotype-specific epitope of Shigella flexneri lipopolysaccharide protects against murine  experimental shigellosis.J Exp Med 182，769-778.

22.Pryamukhina，N.S.&Khomenko，N.A.(1988).Suggestion to supplement Shigella  flexneri classification scheme with the subserovar Shigella flexneri 4c：phenotypic  characteristics of strains.J Clin Microbiol 26，1147-1149.

23.Reynolds，C.M.，Kalb，S.R.，Cotter，R.J.&Raetz，C.R.(2005).A phosphoethanolamine transferase specific for the outer 3-deoxy-D-manno-octulosonic  acid residue of Escherichia coli lipopolysaccharide.Identification of the eptB gene and Ca2+hypersensitivity of an eptB deletion mutant.J Biol Chem 280，21202-21211.

24.Schweda，E.K.，Hegedus，O.E.，Borrelli，S.，Lindberg，A.A.，Weiser，J.N.，Maskell， D.J.&Moxonn，E.R.(1993).Structural studies of the saccharide part of the cell  envelope lipopolysaccharide from Haemophilus influenzae strain AH1-3(lic3+). Carbohydr Res 246，319-330.

25.Simmons，D.A.&Romanowska，E.(1987).Structure and biology of Shigella flexneri O antigens.J Med Microbiol 23，289-302.

26.St Michael，F.，Harper，M.，Parnas，H.，John，M.，Stupak，J.，Vinogradov，E.，Adler， B.，Boyce，J.D.&Cox，A.D.(2009).Structural and genetic basis for the serological  differentiation of Pasteurella multocida Heddleston serotypes 2and 5.J Bacteriol 191， 6950-6959.

27.Stagg，R.M.，Tang，S.S.，Carlin，N.I.，Talukder，K.A.，Cam，P.D.&Verma，N.K. (2009).A novel glucosyltransferase involved in O-antigen modification of Shigella  flexneri serotype 1c.JBacteriol 191，6612-6617.

28.Sun，Q.，Lan，R.，Wang，Y.&other authors(2011).Genesis of a novel Shigella flexneri  serotype by sequential infection of serotype-converting bacteriophages SfX and SfI.BMC Microbiol 11，269.

29.Talukder，K.A.，Islam，Z.，Islam，M.A.&other authors(2003).Phenotypic and  genotypic characterization of provisional serotype Shigella flexneri 1c and clonal  relationships with 1a and 1b strains isolated in Bangladesh.J Clin Microbiol 41，110-117.

30.Tamayo，R.，Choudhury，B.，Septer，A.，Merighi，M.，Carlson，R.&Gunn，J.S. (2005a).Identification of cptA，a PmrA-regulated locus required for  phosphoethanolamine modification of the Salmonella enterica serovar typhimurium  lipopolysaccharide core.J Bacteriol 187，3391-3399.

31.Tamayo，R.，Prouty，A.M.&Gunn，J.S.(2005b).Identification and functional analysis  of Salmonella enterica serovar Typhimurium PmrA-regulated genes.FEMS Immunol  Med Microbiol 43，249-258.

32.Tsai，C.M.&Frasch，C.E.(1982).A sensitive silver stain for detecting  lipopolysaccharides in polyacrylamide gels.Anal Biochem 119，115-119.

33.Verma，N.K.，Brandt，J.M.，Verma，D.J.&Lindberg，A.A.(1991).Molecular  characterization of the O-acetyl transferase gene of converting bacteriophage SF6 that  adds group antigen 6to Shigella flexneri.MolMicrobiol 5，71-75.

34.Wenzel，C.Q.，St Michael，F.，Stupak，J.，Li，J.，Cox，A.D.&Richards，J.C. Functional characterization of Lpt3 and Lpt6，the inner-core lipooligosaccharide  phosphoethanolamine transferases from Neisseria meningitidis.J Bacteriol 192，208-216.

35.Westphal O&K，J.(1965).Bacteriallipopolysaccharides.Extraction with phenol-water  and further applications of the procedure.Methods Carbohydr Chem 5，8.

36.Wright，J.C.，Hood，D.W.，Randle，G.A.，Makepeace，K.，Cox，A.D.，Li，J.， Chalmers，R.，Richards，J.C.&Moxon，E.R.(2004).lpt6，a gene required for  addition of phosphoethanolamine to inner-core lipopolysaccharide of Neisseria  meningitidis and Haemophilus influenzae.J Bacteriol 186，6970-6982.

37.Ye，C.，Lan，R.，Xia，S.&other authors(2010).Emergence of a new  multidrug-resistant serotype X variant in an epidemic clone of Shigella flexneri.J Clin  Microbiol 48，419-426.