模板法制备单分散介孔生物活性玻璃微球的方法

摘要

模板法制备单分散介孔生物活性玻璃微球的方法，属于生物医用材料领域。采用硅源、磷源、钙源、铁源、碱金属或碱土金属源为原料，以三嵌段共聚物或烷基季铵盐型阳离子为表面活性剂，在三维有序大孔聚合物或碳模板中原位溶胶凝胶合成有序介孔生物活性玻璃微球。本发明制得的生物活性玻璃微球，具有良好的生物相容性，生物可降解性，具有有序的介孔结构，较高的比表面积，磁性，颗粒单分散性，环境稳定性等特点，与目前正广泛研究的各种药物传输载体材料相比，优点更全面，作为新型药物控释载体材料具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医用材料领域的产品及方法，具体是一种单分散介孔生物活性玻璃微球（MBGs）及其制备方法。

背景技术

生物活性玻璃是由Larry L Hench教授等人于1971年发明的第三代生物材料，主要包括SiO₂-CaO-P₂O₅系统和SiO₂-CaO系统，部分含有Na₂O、K₂O、MgO、Al₂O₃、B₂O₃、TiO₂、Ag等。生物活性玻璃材料具有良好的生物相容性、生物可降解性，优异的骨诱导能力，并且无毒副作用，目前主要应用于牙科、骨科、骨缺损修复以及软组织损伤愈合等领域，并且作为医疗器械在全世界范围正在逐渐投入使用，在安全性和临床有效性上已经得到美国FDA、欧共体以及中国国家药品监督管理局的认可。生物活性玻璃问世至今已有四十余年，在医学领域有着十分广泛的应用，前景可观。随着研究的发展，生物活性玻璃的研究己经成为材料学、生物学及医学的交叉学科，成为研究热点。

癌症是目前人类面临的难以治愈的主要疾病之一，是威胁人类生命健康的头号杀手！传统给药方式中的抗癌药物对正常细胞具有很大的毒副作用，在体内无选择性扩散，药效低，多次用药给病人带来极大地痛苦。例如，用于治疗癌症的化疗药物在杀死癌细胞的同时也会杀死正常细胞，因此会给患者带来巨大的痛苦。“一次用药，长期安全有效”是癌症患者的心愿。如果能够实现化疗药物靶向传输到患病部位，可控地在患病部位释放，选择性地杀死癌细胞，就可以大大提高药物的疗效，减少药物的用量，避免对健康机体的伤害，减轻病人的痛苦。因此，靶向药物传输和可控释放体系得到了人们的高度关注。国内外针对不同材料在靶向药物领域的可能应用进行了大量的研究，然而，迄今为止真正能够广泛应用于临床的靶向药物传输体系仍然远远不够成熟。

对于药物控释体系而言，药物载体是其核心组成部分，载体不同，药物的负载量和释放行为会相应呈现较大的差别。目前研究比较广泛的药物载体材料有脂质体、生物高分子和多肽，磁性纳米颗粒，介孔或者中空的二氧化硅微球等，并且取得了很大的进展。相比较而言，这些材料各有优缺点，单一的材料很难满足其作为理想药物载体的要求，往往将其复合使用以期获得综合性能更加优异的传输体系。介孔生物活性玻璃，具有优异的生物活性，良好的生物降解能力，均一可调的孔径，规整有序的孔道结构，较高的比表面积和孔容，可以在材料的孔道中固定包埋负载各种药物，并且可对药物起到控释作用，提高药效的持久性；还可利用生物导向作用，准确、有效地击中靶细胞和病变部位，能充分发挥药物的疗效。周艳玲等研究了介孔58S生物活性玻璃对抗癌药物表阿霉素的负载和释放行为，结果表明，作为药物载体，介孔58S生物活性玻璃的载药量是普通溶胶凝胶58S生物活性玻璃的3倍多，而且表现出更长效的缓释性能。药物控释载体是介孔生物活性玻璃最有前景的应用之一。

在最近5年中，关于制备具有药物负载和传输能力的介孔生物活性玻璃的研究正在逐步成为热点研究领域。基于生物活性玻璃极为优异的骨诱导及骨传导性能，人们希望通过利用介孔生物活性玻璃制备骨支架，能够实现药物在骨支架上的负载、传输和在骨支架移植的病灶部位的缓释。负载的药物可以是以治疗疾病或者消炎为目的，也可以具备促进细胞分化和组织再生等功能。

由于生物活性玻璃是由以二氧化硅为主体的网络结构组成，因此在介孔二氧化硅领域取得的研究成果往往同样适用于介孔生物活性玻璃。如果能够借鉴介孔二氧化硅微球靶向药物传输体系的成功经验，制备介孔生物活性玻璃微球（MBGs）并用于靶向药物传输体系的研究有可能得到综合性能更优异的靶向药物传输体系。然而，与人们广泛研究的介孔二氧化硅微球相比，介孔生物活性玻璃微球的制备刚刚引起少数人的关注。目前常用的制备介孔二氧化硅微球的方法往往不适合制备MBGs微球。利用聚苯乙烯等聚合物三维有序大孔模板复制可以得到单分散性很高的微球。同时，由于反应物在模板内部微小的受限空间中反应，有利于复杂的反应物被强制分散，不会因为反应过程中的析出而造成产物组分分布不均匀。因此，对于合成单分散MBGs这种多组分的复杂产物来说，模板复制的办法具有独特的优势。

发明内容

本发明目的是提出利用聚苯乙烯三维有序大孔模板制备一种具有生物活性的药物控释载体材料—介孔生物活性玻璃微球（MBGs）的方法。

本发明将碱金属或碱土金属源与硅源、磷源、钙源、铁源、表面活性剂、无机酸、无水乙醇均匀混合后在具有三维有序的大孔结构的聚苯乙烯或碳模板中原位合成单分散介孔生物活性玻璃微球；所述大孔的孔径为180～470 nm。将硅源、钙源、表面活性剂、无机酸、无水乙醇均匀混合后在具有三维有序的大孔结构的聚苯乙烯或碳模板中原位合成单分散介孔生物活性玻璃微球；所述大孔的孔径为180～470 nm。

具体步骤为：

1）将无机酸、去离子水、无水乙醇和表面活性剂混合搅拌，取得澄清的混合溶液；

2）向以上混合溶液中硅源和钙源，搅拌至完全溶解；

3）将三维有序的孔径为180～470 nm 的大孔聚苯乙烯或碳模板浸入步骤2）取得的混合液浸入中；

4）将浸泡24±1h后的大孔聚苯乙烯或碳模板置于60℃烘箱中，等完全干燥后，去除模板表面多余干凝胶，取得模板与玻璃干凝胶复合物；

5）将上述模板与玻璃干凝胶复合物置于高温炉中600℃下煅烧3±0.1h，再经研磨、超声分散，即得单分散介孔生物活性玻璃微球粉体。

本发明首次创新性地采用模板复制的办法制备出了一系列不同尺寸和组成的单分散介孔生物活性玻璃微球（MBGs）及磁性介孔生物活性玻璃微球（MMBGs），作为药物控释载体，其综合性能更加优异，在药物控释体系中具有巨大的应用潜力。所得微球介孔结构规整有序，形貌为粉末，呈单分散球形，粒径为50～500 nm，孔径范围3～30 nm，BET比表面积为100～800 m²/g。热稳定性高，其作为药物控释载体，具有更加全面优异的综合性能，对获得理想的药物传输体系并用于癌症治疗具有重要意义。

本发明所述硅源为正硅酸四乙酯，钙源为四水合硝酸钙。

在所述步骤2）中还加入碱金属或碱土金属源或磷源或铁源中的一种。本发明中上述材料是组分可调的多组分非晶材料，主要为SiO₂-CaO类、SiO₂-CaO-P₂O₅类和SiO₂-CaO-Fe₂O₃类介孔生物活性玻璃，部分加入Na₂O、MgO、Al₂O₃、TiO₂、Ag等组分。

磷源为磷酸三乙酯；铁源为九水合硝酸铁；碱金属或碱土金属源为碱金属的可溶性盐。

所述表面活性剂为非极性的三嵌段高聚物或烷基季铵盐型阳离子。

所述无机酸为硝酸或盐酸、硫酸。

本发明制备的材料，经表面修饰后，对无机小分子药物表现出明显的缓释能力，可用于功能性蛋白、抗癌药物的控释载体，生物涂层，骨缺损的修复再生及组织工程支架材料。

附图说明

图1为介孔生物活性玻璃微球M75S25C的TEM图。

图2为介孔生物活性玻璃微球MM70S7F的TEM图。

图3为MM70S7F的小角XRD衍射谱图。

图4为MM70S7F的广角XRD衍射谱图。

图5为介孔生物活性玻璃微球的N₂吸附脱附曲线图。

图6为MM70S7F的DLS图。

图7为MM70S7F在SBF降解前的TEM图。

图8为MM70S7F在SBF静态过程降解14 天所获得的降解产物的TEM图。

图9为MM70S7F在SBF动态过程降解7 天后所获得的降解产物的TEM图。

图10为动态过程中MM70S7F在SBF中不同降解时间点的广角XRD图。

图11为MM70S7F负载As₂O₃前的TEM图。

图12为MM70S7F负载As₂O₃后的TEM图。

图13为MM70S7F及载药MM70S7F表面修饰PEG-6000、PEG-20000及PDLLA-PEG后的FTIR图。

图14为MM70S7F-As₂O₃以及经三种聚合物表面修饰后的载药微球的静态体外药物释放曲线以及PEG-20000体系的动态体外药物释放曲线图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步说明，但不仅限于实施例。

下表为不同的玻璃微球的组分摩尔比表：

一、实施例1

1、制备不同粒径75S25C介孔生物活性玻璃微球（M75S25C）：

（1）将1.8 g非极性的三嵌段共聚物Pluronic F127（以下简称F127）加入0.04 g 硝酸溶液（2mol/L）、0.1 g 去离子水与4 g无水乙醇的混合液中，搅拌，取得澄清的混合溶液。

（2）向以上混合溶液中加入 0.59 g 四水合硝酸钙，搅拌至完全溶解。

（3）加入 1.56 g 正硅酸四乙酯，继续搅拌2 h。

1）将无机酸与去离子水、无水乙醇混合，加入表面活性剂，搅拌，取得澄清的混合溶液；

2）向以上混合加入碱金属或碱土金属源和钙源、铁源，搅拌至完全溶解，然后再加入硅源和磷源，继续搅拌；

硅源为正硅酸四乙酯（TEOS）；磷源为磷酸三乙酯；钙源为四水合硝酸钙；铁源为九水合硝酸铁；碱金属或碱土金属源为碱金属的可溶性盐。

（4）上述溶液平行制备4份。

（5）分别浸入孔径为470 nm、390 nm、250 nm、180 nm的三维有序大孔聚苯乙烯或碳模板，过夜浸泡。

（6）置于60℃烘箱中，溶胶凝胶化3 天，至完全干燥。

（7）去除模板表面多余凝胶，于高温炉中600℃下煅烧3 h，研磨、超声分散后即得单分散M75S25C生物活性玻璃微球粉体。

2、效果分析：

由470 nm三维有序大孔聚苯乙烯或碳模板制得的M75S25C生物活性玻璃微球，介孔结构规整有序，如图1所示，孔径均一；介孔孔径为4 nm，BET比表面积为479 m²/g。

如图5所示，在介孔生物活性玻璃微球的N₂吸附脱附曲线图中，插图为介孔孔径分布图。曲线a为M75S25C，表明M75S25C具有较高的比表面积和较均一的介孔孔径。

二、实施例2

1、制备不同粒径70S7F磁性介孔生物活性玻璃微球（MM70S7F）：

（1）将1.8 g F127 加入0.04 g 硝酸溶液（2mol/L）与4 g 无水乙醇的混合液中，搅拌至澄清。

（2）加入 0.59 g 四水合硝酸钙和0.3 g 九水合硝酸铁，搅拌至完全溶解。

（3）加入 1.56 g 正硅酸四乙酯，继续搅拌2 h。

（4）上述溶液平行制备4份。

（5）分别浸入孔径为470 nm、390 nm、250 nm、180 nm的三维有序大孔聚苯乙烯/碳模板，过夜浸泡。

（6）置于60℃烘箱中，溶胶凝胶化3 天，至完全干燥。

（7）去除模板表面多余凝胶，于高温炉中600℃下煅烧3 h，研磨、超声分散后即得单分散MM70S7F生物活性玻璃微球粉体。

2、效果分析：

由470 nm三维有序大孔聚苯乙烯或碳模板制得的MM70S7F生物活性玻璃微球，介孔结构规整有序，孔径均一，如图2所示。介孔孔径为5 nm，BET比表面积为300 m²/g.平均粒径约240 nm，粒径分布指数PDI为0.0479，呈现良好的单分散性，说明对于合成单分散MBGs这种多组分的复杂产物来说，模板复制的办法具有独特的优势。

从图3的MM70S7F的小角XRD衍射谱图和图4的广角XRD衍射谱图可见，该材料为具有有序介孔结构的非晶材料。

如图5所示，在介孔生物活性玻璃微球的N₂吸附脱附曲线图中，插图为介孔孔径分布图。曲线a为MM70S7F，表明MM70S7F具有较高的比表面积和较均一的介孔孔径。曲线a、b分别为M75S25C、MM70S7F，表明该材料具有较高的比表面积和较均一的介孔孔径。

图6为MM70S7F的DLS图，表明该微球平均粒径约为240 nm，具有良好的单分散性。

3、MM70S7F生物活性玻璃微球的体外降解实验：

（1）将10 mg MM70S7F浸泡在10 mL 模拟体液SBF（Simulated Body Fluid，pH=7.4，c(PO₄^3-)=0.01 M，SBF含有与人体血液相同的离子和离子浓度）。

（2）置于水浴恒温振荡器中，设置恒温37℃及转速170 rpm，分别采用静态和动态过程研究MMBGs的降解行为。静态过程中，在设定取样时间点取样后加入相等体积的新鲜SBF；动态过程则是在取样点取样后，以新鲜SBF模拟体液全部替换原降解液。

从图7、8、9可见：本发明制备的材料经体外降解实验表明其具有优异的降解速率，其在更换SBF的动态降解过程中的降解速率更快，因而能很好地满足作为药物控释载体材料的要求。

微球表面修饰结果见图10。动态过程中MM70S7F在SBF中不同降解时间点的广角XRD图。表明该材料具有良好的降解性能和生物活性，能在较短时间内生成羟基磷灰石，能很好地复合骨组织工程的要求。

4、MM70S7F生物活性玻璃微球的药物负载：

用一定量As₂O₃的药物溶液浸润已知质量的MM70S7F粉末，将其置于真空干燥箱中，真空条件下使其快速干燥，完成一次灌注周期。多次重复灌注可调节其载药量。

其载药后形貌变化见图11、12所示，图11为MM70S7F负载As₂O₃前，图12为MM70S7F负载As₂O₃后，表明本发明制备的MBGs能够有效负载无机小分子药物（如三氧化二砷）、有机小分子药物（如紫杉醇、多西紫杉醇等）、生化药物（如生物蛋白）等。比如：对三氧化二砷无机小分子药物的负载能力为18wt%-40wt%，是普通生物活性玻璃的2-4倍，表现出较高的药物负载能力。

5、MM70S7F及其载药微球的表面修饰（整个过程需在无水避光条件下进行）：

（1）将MMBGs及MMBGs-As₂O₃分散在氯仿中，滴加1 d丙二酰氯，常温磁力搅拌1 h。

（2）滴加PEG和PDLLA-PEG的氯仿溶液，继续搅拌1 h。反应结束后，用氯仿反复离心洗涤三次。

微球表面修饰结果见图13所示，其中曲线a表示MM70S7F微球的FTIR谱图；曲线b表示PDLLA-PEG的FTIR谱图；曲线c表示负载As₂O₃的MM70S7F微球表面修饰PDLLA-PEG后的FTIR谱图；曲线d表示PEG的FTIR谱图；曲线e表示负载As₂O₃的MM70S7F微球表面修饰PEG-6000后的FTIR谱图；曲线f表示负载As₂O₃的MM70S7F微球表面修饰PEG-20000后的FTIR谱图。

以上图表明：该材料表面可修饰功能性高分子材料，用以控释药物的释放行为。

6、MM70S7F载药微球及其表面修饰所得复合微球的体外药物释放实验：

（1）称取2 mg载药微球分散于装有2 mL PBS（pH 7.4，0.01 M）缓冲溶液的透析袋中并密封。

（2）将其浸入含有200 mL PBS的离心管中，置于水浴恒温振荡器中，设置恒温37℃及转速170 rpm/min。于设计时间点取样，采用Optima 7300 DV电感耦合等离子体光谱仪（ICP）进行测试。

（3）取样时间从15 min到14 h。同时采用静态和动态处理过程研究药物释放行为，静态过程中，在设定取样时间点取样后加入相等体积的新鲜PBS；动态过程则是在取样点取样后，以新鲜PBS模拟体液全部替换原降解液。

药物释放性能见图14，表明PDLLA-PEG体系对As₂O₃具有最为显著的缓释作用，在动态过程中，PEG-20000体系可实现对As₂O₃的持续缓释。

本发明制备的MBGs，其药物缓释效果随着材料组成、结构、溶液性质以及表面修饰材料性能的变化而变化，从而能够通过改变条件达到对药物释放速率的控制。比如：MBGs在表面修饰PLA、PEG等高分子材料后对负载的三氧化二砷药物表现出明显的药物缓释效果。

三、实施案例3

不同粒径70S30C介孔生物活性玻璃微球（M70S30C）的制备及体外降解实验：

M70S30C的制备：

（1）将1.8 g F127 加入0.04 g 硝酸溶液（2mol/L）、0.1 g 去离子水与4 g无水乙醇的混合液中，搅拌至澄清。

（2）加入 0.71 g 四水合硝酸钙，搅拌至完全溶解。

（3）加入 1.45 g 正硅酸四乙酯，继续搅拌2 h。

（4）上述溶液平行制备4份。

（5）分别浸入孔径为470 nm、390 nm、250 nm、180 nm的三维有序大孔聚苯乙烯/碳模板，过夜浸泡。

（6）置于60℃烘箱中，溶胶凝胶化3 天，至完全干燥。

（7）去除模板表面多余凝胶，于高温炉中600℃下煅烧3 h，研磨、超声分散后即得单分散M70S30C生物活性玻璃微球粉体。

体外降解实验同实施例2。

四、实施案例4

不同粒径65S7F磁性介孔生物活性玻璃微球（MM65S7F）的制备及体外降解实验：

MM65S7F的制备：

（1）将1.8 g F127 加入0.04 g 硝酸溶液（2mol/L）与4 g 无水乙醇的混合液中，搅拌至澄清。

（2）加入0.71 g 四水合硝酸钙和0.3 g 九水合硝酸铁，搅拌至完全溶解。

（3）加入1.45 g 正硅酸四乙酯，继续搅拌2 h。

（4）上述溶液平行制备4份。

（5）分别浸入孔径为470 nm、390 nm、250 nm、180 nm的三维有序大孔聚苯乙烯/碳模板，过夜浸泡。

（6）置于60℃烘箱中，溶胶凝胶化3 天，至完全干燥。

（7）去除模板表面多余凝胶，于高温炉中600℃下煅烧3 h，研磨、超声分散后即得单分散MM65S7F生物活性玻璃微球粉体。

体外降解实验同实施例2。

五、实施案例5

不同粒径58S介孔生物活性玻璃微球（M58S）的制备及体外降解实验：

M58S的制备：

（1）将2.1 g F127 加入0.08 g  盐酸溶液（2mol/L）、0.2 g 去离子水与2 g 无水乙醇的混合液中，搅拌至澄清。

（2）加入1.70 g 四水合硝酸钙，搅拌至完全溶解。

（3）加入2.5 g 正硅酸四乙酯和0.3 g 磷酸三乙酯，继续搅拌2 h。

（4）上述溶液平行制备4份。

（5）分别浸入孔径为470 nm、390 nm、250 nm、180 nm的三维有序大孔聚苯乙烯/碳模板，过夜浸泡。

（6）置于60℃烘箱中，溶胶凝胶化3 天，至完全干燥。

（7）去除模板表面多余凝胶，于高温炉中600℃下煅烧3 h，研磨、超声分散后即得单分散M58S介孔生物活性玻璃微球粉体。

体外降解实验同实施例2。

六、实施案例6

不同粒径MgO掺杂58S介孔生物活性玻璃微球（M58S6M）的制备及体外降解实验：

M58S6M的制备：

（1）将2.1 g F127 加入0.08 g 盐酸溶液（2mol/L）、0.2 g 去离子水与2 g 无水乙醇的混合液中，搅拌至澄清。

（2）加入1.41 g 四水合硝酸钙和0.31 g 六水合硝酸镁，搅拌至完全溶解。

（3）加入2.5 g 正硅酸四乙酯和0.3 g 磷酸三乙酯，继续搅拌2 h。

（4）上述溶液平行制备4份。

（5）分别浸入孔径为470 nm、390 nm、250 nm、180 nm的三维有序大孔聚苯乙烯/碳模板，过夜浸泡。

（6）置于60℃烘箱中，溶胶凝胶化3 天，至完全干燥。

（7）去除模板表面多余凝胶，于高温炉中600℃下煅烧3 h，研磨、超声分散后即得单分散M58S6M介孔生物活性玻璃微球粉体。

体外降解实验同实施例2。

七、实施案例7

不同粒径ZnO掺杂58S介孔生物活性玻璃微球（M58S6Z）的制备及体外降解实验：

M58S6Z的制备：

（1）将2.1 g F127 加入0.08 g 盐酸溶液（2mol/L）、0.2 g 去离子水与2 g 无水乙醇的混合液中，搅拌至澄清。

（2）加入1.41 g 四水合硝酸钙和0.36 g 六水合硝酸锌，搅拌至完全溶解。

（3）加入2.5 g 正硅酸四乙酯和0.3 g 磷酸三乙酯，继续搅拌2 h。

（4）上述溶液平行制备4份。

（5）分别浸入孔径为470 nm、390 nm、250 nm、180 nm的三维有序大孔聚苯乙烯/碳模板，过夜浸泡。

（6）置于60℃烘箱中，溶胶凝胶化3 天，至完全干燥。

（7）去除模板表面多余凝胶，于高温炉中600℃下煅烧3 h，研磨、超声分散后即得单分散M58S6Z介孔生物活性玻璃微球粉体。

体外降解实验同实施例2。

通过以上各例说明：以本发明制备的单分散介孔生物活性玻璃微球经表面修饰后，对无机小分子药物表现出明显的缓释能力，可用于功能性蛋白、抗癌药物的控释载体，生物涂层，骨缺损的修复再生及组织工程支架材料。