摘要：2013年7月份,从湖南株洲市采集的具有典型草鱼出血病症状的草鱼样品,取临床症状明显病鱼肝、脾和肾组织,经研磨、过滤除菌处理后接种草鱼吻端成纤维细胞(PSF).接种后,PSF细胞未出现明显细胞病变;感染细胞固定后经电镜观察发现,细胞质内有大量病毒聚集或散在分布,病毒无囊膜,双层衣壳,呈正廿面体对称,直接70nm左右,为典型的呼肠孤病毒特点,将新分离的病毒暂命名为GCRV-HuNan1307.将病料组织和感染细胞采用三重PCR方法进行检测,均扩增出200bp左右大小的特异性条带,进一步测序分析表明该分离株与HZ08、GD108等Ⅱ型GCRV的序列同源性较高;HuNan1307和HZ08分离株感染细胞经IFA分析表明,细胞内可观察到荧光信号,而JX0901和104感染细胞及阴性对照细胞没有检测到荧光信号;将病毒提纯后提取基因组进行SDS-PAGE凝胶电泳带型分析显示,具有草鱼呼肠孤病毒11个节段的特征,各节段的迁移率与HZ08株的相似,与JX0901和104带型分布差异较大;经PSF细胞分离的病毒液分别感染健康草鱼和稀有鮈鲫,能使感染草鱼和稀有鮈鲫出现典型的草鱼出血病症状,最终死亡率分别为96.7％和100％,表明新分离株HuNan1307为一株强毒株;采用单引物扩增技术获得了HuNan1307分离株基因组全长序列(各基因节段GenBank登录号为:KU254567～KU254576),基因组序列全长为24703bp,G+C含量为52.32％,11基因节段共7个结构蛋白和5个非结构蛋白.该分离株的基因组各节段基因序列长度与HZ08株的一致,S1-S11基因长度为3928nt至1024nt,且所有节段末端都有相同的保守序列:5'GUAA/UUUU}}UU CAUC3'.同源性分析表明HuNan1307的核苷酸序列与HZ08、GD108等Ⅱ型毒株的同源性在94％至99％不等,氨基酸序列同源性在96％至100％不等,而与873,104等Ⅰ和Ⅲ型毒株的同源性较低.基于RdRp基因编码的氨基酸序列构建的遗传进化树显示,所有的GCRV聚为3大类,HuNan1307和GD108、HZ08、106、109等草鱼呼肠孤病毒聚为一支;GCRV873、GZ1208、GCHV和AGCRV聚为另外一支;GCRV104则单独聚为一支,与前面报道的草鱼呼肠孤病毒分为三个基因型结果一致.
