重组酶聚合酶扩增技术检测新型隐球菌DNA

摘要

目的 探讨应用重组酶聚合酶(RPA)技术对新型隐球菌快速核酸检测,建立新型隐球菌的即时检测(POCT)方法.方法 磁珠法提取新型隐球菌标准菌株ATCC32609、150株阴性质控菌株(本实验室质控菌株和临床分离菌株)DNA.在新型隐球菌DNA的5.8SrRNA编码基因区域设计6对候选引物,以ATCC32609作为建立RPA反应体系的参考菌株,凝胶法RPA基础试剂盒筛选可稳定扩增出新型隐球菌DNA片段的引物.依次稀释ATCC32609的McF2.0菌悬液,半定量法观察扩增反应阳性引物+ATCC32609的扩增反应,扩增反应阳性引物+150株阴性对照菌株验证该反应特异性.对扩增反应阳性引物设计探针,实时荧光RPA法观察ATCC32609的扩增反应,150株阴性对照菌株验证该反应特异性.取实验室保存10株新型隐球菌临床分离株和100份临床样本(包括脑脊液50份、痰15份、胸腹水15份、静脉血20份),分别用荧光法RPA和oasig实时荧光PCR法进行DNA扩增,观察是否存在扩增反应.结果 引物2、5、6的目的条带清晰,无弥散拖尾现象,引物扩增反应阳性;对ATCC32609菌悬液1∶105稀释加入引物后扩增反应阳性;引物2、5、6均属于新型隐球菌编码核糖体RNA的DNA片段,比对结果符合率为100％;引物6扩增阴性对照菌株后,凝胶电泳未见扩增条带.引物6设计探针实时荧光反应结束时可见S形阳性扩增曲线;所有阴性对照菌株扩增结果阴性;对ATCC32609菌悬液1∶105稀释后加入引物6和探针仍可见阳性扩增曲线;以引物6和相应探针对10株新型隐球菌菌株扩增后均可见S形阳性扩增曲线.荧光法RPA试剂、oasig实时荧光PCR法检测100份临床样本中扩增反应阳性的分别为40、40份.结论 RPA技术检测新型隐球菌DNA,实时荧光法RPA技术检测新型隐球菌DNA方便快捷、准确性高.