反转录病毒载体介导转化生长因子β_1基因体外转染兔膝关节软骨细胞的表达

摘要

背景:将功能基因片段整合到基因载体内,再将基因载体转染入靶细胞中或转染入关节腔内,通过转基因的靶细胞持续大量分泌功能基因产物,在一个较长的时期内保持局部治疗浓度,可修复关节软骨损伤。目的:以重组反转录病毒载体介导转化生长因子β1体外转染兔膝关节软骨细胞,观察其表达情况及其对软骨细胞生物学性状的影响。方法:采用胰酶消化法分离培养兔软骨细胞。载体经PLNCX2HindⅢ/NotⅠ双酶切、去磷酸化后,与载体pDsRed2双酶切得到大的部分多克隆位点和RFP基因连接,构建PLNCX2-RFP。转化生长因子β1基因从PGEMT-TGF中扩增,经双酶切后与PLNCX2-RFP连接,构建PLNCX2-TGFβ1-RFP。包装反转录病毒载体,并检测病毒上清滴度。将培养的兔膝关节软骨细胞分组转染:对照组(不做任何转染)、转染PLNCX2组、转染PLNCX2-TGFβ1-RFP组,持续筛选2周,观察细胞变化。收集稳定转染的细胞上清液,以NO检测试剂盒检测基因转染对软骨细胞的影响,以ELISA法检测细胞培养上清液中人转化生长因子β1表达。结果与结论:重组基因PLNCX2-TGFβ1-RFP经酶切鉴定测序TGFβ1、RFP、序列均正确,表明构建成功预期的真核表达载体PLNCX2-TGFβ1-RFP。转染到包装细胞并筛选培养后,病毒滴度为1×106CFU。稳定转染软骨细胞后可观察到红色荧光,证明转染成功。持续筛选2周,散在贴壁细胞形成阳性克隆,逐渐弥漫融合,并有细胞簇出现,双核多见,细胞增生活跃。转染PLNCX2-TGFβ1-RFP组NO浓度高于对照组、转染PLNCX2组(P<0.05),对照组、转染PLNCX2组间差异无显著性意义。对照组与转染PLNCX2组均无转化生长因子β1表达,转染PLNCX2-TGFβ1-RFP组转化生长因子β1质量浓度为(28.08±3.73)ng/L。提示反转录病毒载体PLNCX2介导的人转化生长因子β1能有效转染到兔膝关节软骨细胞并获得稳定表达,同时转染后的软骨细胞增生活跃。