重组人IL-1Ra与TGF-β1联合基因体外转染兔膝关节软骨细胞的研究

摘要

背景:多基因联合转染具有增强功能基因协同效应、消除短板差异等作用,因而目前被受到广泛重视。目的:观察以逆转录病毒(RV)为载体,介导白介素-1受体拮抗蛋白(IL-1Ra)基因单独转染及其与转化生长因子-β1(TGF-β1)基因共同转染兔膝软骨细胞后的表达,及对其增殖代谢的影响。方法:构建逆转录病毒载体PLNCX2-IL-1Ra-GFP 与 PLNCX2-TGF-β1-RFP,将其转染至包装细胞 PT67,待形成阳性克隆后扩增培养,收集病毒上清,并计算病毒上清滴度。将体外培养的软骨细胞分为空白转染组、PLNCX2空载体转染组、IL-1Ra单基因转染组及IL-1Ra +TGF-β1双基因转染组。酶联免疫吸附分析法(ELISA)进行瞬时基因表达(细胞转染后48 h)及稳定基因表达(筛选后4周)的检测;免疫组织化学染色法检测各组IL-1Ra、TGF-β1及Ⅱ型胶原的表达;流式细胞仪检测各组细胞生长周期比例。结果:PLNCX2-IL-1Ra-GFP 与 PLNCX2-TGF-β1-RFP 转染包装细胞后分别有绿色荧光与红色荧光表达;空白组与PLNCX2空载体转染组的上述指标无统计学差异(P>0.05);ELISA检测示基因转染组有明显基因表达;与空白组及PLNCX2空载体转染组相比,双基因转染组IL-1Ra、TGF-β1、Ⅱ型胶原含量明显提高,IL-1Ra基因转染组IL-1Ra含量提高明显,但TGF-β1、Ⅱ型胶原含量提高不明显;双基因转染组软骨细胞位于S期的比例明显增高,与其他组比较有统计学差异(P<0.05)。结论:逆转录病毒载体构建成功,基因转染软骨细胞后可获得稳定表达,双基因转染的软骨细胞生物学活性优于单基因转染,为基因治疗骨关节炎(OA)的研究提供实验基础。