酸性纤维素酶CBH Ⅱ基因与非抗性穿梭表达载体的重组及在乳酸杆菌的表达及其活性检测

摘要

以SmaⅠ和SphⅠ双酶切pMD18-T-CBHⅡ和以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thyA)为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体 pW425t,胶回收酸性纤维素酶CBHⅡ基因和载体大片段,并将纯化的CBH Ⅱ基因和表达载体pW425t大片段进行连接,构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-CBHⅡ.将pW425t-CBHⅡ转化至thyA基因缺陷型的乳酸杆菌感受态细胞中,通过质粒提取、酶切鉴定、PCR鉴定、测序分析和生长功能弥补筛选阳性克隆.SDS-PAGE分析,可见约49.6 ku的蛋白,并且刚果红染色显示重组乳酸杆菌可产生明显的水解圈.