猪A组轮状病毒Vp7基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达

摘要

以猪A组轮状病毒mRNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了981bp的Vp7基因,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至克隆载体pGEM-TVector中,构建出克隆质粒pGEM-T-Vp7.同时以SacⅠ和KpnⅠ分别双酶切pGEM-T-Vp7和以胸苷酸合成酶基因(thymidylatesynthase,thyA)为选择压力的非抗生素抗性的可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的质粒载体pW425t,并将纯化的Vp7基因亚克隆至表达载体pW425t中,构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-Vp7.将pW425t-Vp7转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coliX51中,经生长功能弥补筛选阳性克隆,通过SDS-PAGE分析,可见约37.07kD蛋白的,约占菌体总蛋白的15﹪.由Westernblot分析,表明该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性,从而为重组载体pW425t-Vp7在乳酸菌受体菌株中表达提供理论基础和依据.